用于接種疫苗的免疫原性絡(luò)合物及其獲得方法
【專利說明】用于接種疫苗的免疫原性絡(luò)合物及其獲得方法
[0001] 本發(fā)明設(shè)及包含聚合抗原、甘露聚糖和二醒的免疫原性復(fù)合物，包含該免疫原性 復(fù)合物的組合物，W及其作為免疫應(yīng)答刺激物和疫苗的用途。同樣地，本發(fā)明設(shè)及使用二 醒，基于抗原和甘露聚糖同時進行聚合和綴合而獲得所述的免疫原性復(fù)合物的方法。因此， 本發(fā)明屬于免疫學(xué)和疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的范圍內(nèi)，W及治療和預(yù)防過敏反應(yīng)的領(lǐng)域范圍內(nèi)。
【背景技術(shù)】
[0002] 樹突狀細胞(DC)是?？诟咝У卮碳細胞的抗原呈遞細胞，并且鑒于此，它們基本 用于誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。未成熟的DC策略性地分布于組織和器官中，其中它們作為哨兵， 在它們的微環(huán)境中不斷地取得抗原樣品。作為對不同刺激(包括抗原本身、微生物有機體的 產(chǎn)物W及組織危險物信號）的應(yīng)答，DC開始成熟過程，運使得DC在周圍攜帶由它們本身所負 載的抗原遷移至次級淋己器官的T區(qū)。在此，顯示HLA-II和共刺激分子表達增多的成熟DC與 T細胞相互作用，將抗原性的膚(經(jīng)DC加工后）呈遞給T細胞，并刺激T細胞開始特異性的應(yīng) 答。
[0003] 未成熟的DC通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、微胞欽作用和吞隧作用捕獲抗原。有多種 不同的受體與內(nèi)吞攝入有關(guān)，其中發(fā)現(xiàn)了甘露糖受體(MRKCD206和CD209)。它們通過碳水 化合物識別結(jié)構(gòu)域而識別末端甘露糖殘基、海藻糖和/或N-乙酷氨基葡萄糖。天然配體包括 細菌來源的產(chǎn)物(糖蛋白和糖脂），W及具有高的甘露糖含量的哺乳動物糖蛋白。MR在巨隧 細胞和未成熟的DC中表達，與甘露糖基化的抗原的內(nèi)吞作用有關(guān)，用于其加工和T細胞呈 遞。
[0004] 在I巧抗體介導(dǎo)的過敏狀況中，免疫治療是W給予治療疫苗為基礎(chǔ)的，運些疫苗抗 原與過敏患者所敏感的那些為相同的變應(yīng)原。變應(yīng)原為得自于花粉、塵蛾、上皮細胞等的蛋 白質(zhì)，它們是患者所呼吸(環(huán)境吸入器)的空氣中所攜帶的超級結(jié)構(gòu)。廣泛接受的是，運些疫 苗的臨床功效與所傳遞的變應(yīng)原的劑量有關(guān)，運樣WHO和得自于科學(xué)社會的共同指導(dǎo)原則 建議應(yīng)該使用足夠的變應(yīng)原濃度來制備疫苗。運種要求意味著患者對疫苗劑量的過敏反應(yīng) 設(shè)及不利作用的風(fēng)險，而根據(jù)規(guī)定所述的作用應(yīng)該受到限制。避免運種風(fēng)險的方式在于基 于改性的變應(yīng)原(類變應(yīng)原）來制備疫苗，其中所述的變應(yīng)原顯示出針對I巧抗原的較低的 反應(yīng)能力(較低的變應(yīng)原性）。
[0005] 基于使用甲醒和/或戊二醒來處理變應(yīng)原的化學(xué)修飾在疫苗制造商中最廣泛地使 用。醒基(R-CHO)與存在于變應(yīng)原氨基酸中的氨基(R-NH2)(例如賴氨酸）的反應(yīng)是此類修飾 的基礎(chǔ)。與甲醒(其為單醒)相反，戊二醒為具有2個R-C冊基的二醒，其中所述的R-CHO基能 夠與不同分子中存在的賴氨酸R-NH2反應(yīng)。運導(dǎo)致變應(yīng)原聚合，W及與特異性I巧抗體(通過 甲醒形成的類變應(yīng)原是基于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾，而不是基于它們的聚合)的反應(yīng)性受損。由 于I巧抗體失去了與它們的抗原決定簇(變應(yīng)原結(jié)合位點)反應(yīng)的可及度，并減少了 I巧致敏 的肥大細胞(其被I巧所活化)的數(shù)量，所W認為運種聚合確定了類變應(yīng)原較低的變應(yīng)原性。 聚合的變應(yīng)原的變應(yīng)原性損失可W意味著免疫原性損失，運可W降低運些制備物的臨床功 效。已經(jīng)表明聚合會降低DC中MR與變應(yīng)原甘露糖殘基的接近，W及運對于聚合的變應(yīng)原的 免疫原性損失而言是決定性的。運由W下事實所支持:就變應(yīng)原攝入而言，甘露糖殘基為DC 所用的主要配體之一，并且運些細胞在將變應(yīng)原呈遞給應(yīng)答T細胞中起重要的作用。
[0006] 用于將糖與蛋白質(zhì)綴合的方法主要基于通過氧化過程來活化糖，從而通過Cis-乙 二醇基的轉(zhuǎn)化而生成反應(yīng)性醒基(R-CHO)。在使用例如高艦酸鹽處理后在氧化的糖中生成 的R-C冊可W與賴氨酸的E-氨基反應(yīng)，從而形成Schiff堿。由于它們的碳水化合物殘基用于 綴合并避免了與其生物學(xué)活性有關(guān)的蛋白質(zhì)部分，所W運種方法學(xué)非常適用于綴合糖蛋白 (例如酶、抗體）。
[0007] 盡管使用高艦酸鹽的糖氧化也已經(jīng)報告為對蛋白質(zhì)(包括變應(yīng)原(Weinberger et al.2013.J Control Release,165:101-109))進行甘露糖基化的方式（Masarova et al. 2002. Int .J.Polymer .Anal .Qiaract. ,7:106-116)，但是將聚合的抗原進行甘露糖基化 的使用具有2個主要的缺點：
[0008] a)糖的氧化使得相鄰的碳原子之間的鍵產(chǎn)生了斷裂，其中所述的碳原子包含徑基 (OH)并且為反應(yīng)性醒生成的基礎(chǔ)。所述的斷裂影響了甘露糖的結(jié)構(gòu)（Shibuya，N.，et al. 1988. J. Biol. Chem.，263: 728-7:34)，從而改變了其結(jié)合識別甘露糖的凝集素的能力 (Masarova et al.2001,Chem.化P.55:130-135)，及其DC活化能力（Sheng et al, 2006. Immunology, 118:372-383)。盡管甘露糖結(jié)構(gòu)整體性的損失可W通過降低氧化程度而 減小至最低(Masarova et al.2001 ,Chem.Pap.55:130-135)，但是在輕度條件下的綴合效 率服從于待甘露糖基化的蛋白質(zhì)的本性(Weinberger et al. 2013, J.Conhol Release, 165:101-109)。為了保護天然形式的甘露糖，已經(jīng)試圖在高溫下通過糖基化來實施蛋白質(zhì) 的甘露糖基化，但是在氧氣缺乏下，結(jié)果為陰性（K a n S k a e t al.2008.Biotechnol.Appl.Biochem.49:57-64)。
[0009] b)在氧化后活化的甘露糖生成了反應(yīng)性醒，其必須與待甘露糖基化的蛋白質(zhì)的游 離氨基反應(yīng)。但是，蛋白質(zhì)與戊二醒的聚合使得運些氨基急劇減少，因為它們已經(jīng)用于它們 與戊二醒本身的反應(yīng)中。在運些條件下，經(jīng)活化用于將蛋白質(zhì)（之前使用戊二醒處理過)甘 露糖基化的甘露糖的效率可能極低，運是因為當(dāng)缺乏甘露糖可W結(jié)合的氨基時，其為戊二 醒的聚合能力（Silva et al.2004.Food Technol.Biotechnol.42:51-56)。運種不便性不 僅影響聚合的變應(yīng)原的甘露糖基化，而且影響與戊二醒(最終認為其可W被甘露糖基化)聚 合的任何蛋白質(zhì)的甘露糖基化。
[0010] Patterson等人 1977Q Allergy Clinical Immunology 59:314-319)描述了變應(yīng) 原與戊二醒的聚合(禾本科花粉）。由于聚合的變應(yīng)原顯示I姐抗體致敏的肥大細胞的活化 能力降低，所W聚合的變應(yīng)原是低變應(yīng)原的。
[0011] Subiza等人2008(Clinical and Experimental Allergy,39:987-994)描述了用 于過敏中免疫治療的戊二醒（也稱為類變應(yīng)原）修飾的變應(yīng)原（禾本科花粉、Trisetum paniceum和喜馬拉雅鴨茅(喜馬拉雅鴨茅））的用途。研究者報告使用通過與戊二醒聚合而 得到的禾本科類變應(yīng)原的接種疫苗是有效的。
[0012] fleydenreich 等人2012 (Immunology, 136:208-217)描述 了在由梯牧草(梯牧草)和 垂枝枠 (Betula verrucosa)物種的完整花粉得到的變應(yīng)原提取物與它們相應(yīng)的戊二醒或 甲醒修飾的類變應(yīng)原之間，免疫原性和變應(yīng)原性的差異比較研究。報告，使用戊二醒進行修 飾比使用甲醒進行修飾會使得類變應(yīng)原的變應(yīng)原性和免疫原性降低更多，并且DC不會高效 地捕獲運種類型的修飾的變應(yīng)原。
[0013] Weinberger等人2013(Journal of Control Release, 165:101-109)描述了變應(yīng) 原蛋白質(zhì)（卵清蛋白和木瓜蛋白酶)與甘露糖的綴合，其中通過使用高艦酸鹽進行輕度氧化 而活化糖。根據(jù)待甘露糖基化的蛋白質(zhì)而得到不同的效率程度。報告，甘露糖基化的綴合物 在體內(nèi)被DC所捕獲，并且在小鼠中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，因此它們可W用于免疫治療。
[0014] 因此，在本領(lǐng)域的水平下，需要提供基于聚合的且甘露糖基化的抗原而獲得疫苗 的方法，該方法為目前本領(lǐng)域水平下所使用的那些方法的備選方法，并且其允許抗原聚合 W及W高效的方式與甘露糖綴合，而不會使糖損失它們的結(jié)構(gòu)完整性并且不會使聚合性質(zhì) (較低的變應(yīng)原性)受到影響，因此基于聚合的且甘露糖基化的蛋白質(zhì)的疫苗通過改善它們 被DC的攝入而增加其免疫原性。
[001引發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)向天然蛋白質(zhì)抗原與甘露聚糖的混合物中加入二醒允許抗 原聚合，同時使抗原與甘露聚糖綴合，運可W獲得免疫原性復(fù)合物或疫苗，該免疫原性復(fù)合 物或疫苗在個體中能夠刺激或降低免疫應(yīng)答的，而不會引發(fā)對該復(fù)合物的過敏反應(yīng)，并且 能夠被樹突狀細胞(DC)所識別并捕獲。
[0017] 基于上述發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)研發(fā)了本發(fā)明的一系列的方面，在下文中將詳細描述運些方 面。
[001引本發(fā)明的免疫復(fù)合物
[0019] 如之前所提及，向蛋白質(zhì)(抗原)和甘露聚糖的混合物中加入二醒(特別是戊二醒） 允許抗原聚合，同時抗原與甘露聚糖綴合，運可W獲得免疫原性復(fù)合物或疫苗。
[0020] 因此，在本發(fā)明的一個方面中，設(shè)及免疫原性復(fù)合物，下文稱為"本發(fā)明的免疫原 性復(fù)合物"，其包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醒。
[0021] 在本發(fā)明中，"免疫原性復(fù)合物"可理解為一個或兩個單元的結(jié)合，其中所述的單 元通過化學(xué)鍵(化學(xué)綴合)和通過物理誘捕(物理綴合)而保持彼此綴合，所述的多個單元為 聚合的抗原、甘露聚糖和二醒。
[0022] "聚合的抗原"是指抗原單體彼此鍵合而形成的聚合物，其中所述的抗原單體可W 不同或相同。因此，在具體的實施方案中，聚合物的抗原包含彼此相同或不同的至少2個抗 原。"抗原"是指在受試對象(人類或動物）的有機體中在體液和細胞水平下能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng) 答的，或者在與免疫細胞接觸時能夠誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答(免疫細胞擴增、活化和/或成熟、產(chǎn) 生細胞因子或抗體）的任何物質(zhì)。具體而言，抗原為可W為變應(yīng)原的蛋白質(zhì)，由感染試劑衍 生的蛋白質(zhì)，腫瘤細胞，所述的蛋白質(zhì)的膚或片段，由所述的蛋白質(zhì)得到的重組蛋白質(zhì)，或 者甚至能夠誘導(dǎo)指定的應(yīng)答的合成膚。在具體的實施方案中，所述的抗原為變應(yīng)原。
[0023] "變應(yīng)原"是指在個體中能夠引起過敏的物質(zhì)，換言之，是指被個體的免疫系統(tǒng)識 別為外來的，導(dǎo)致免疫應(yīng)答(主要是產(chǎn)生E型免疫球蛋白（I巧））的物質(zhì)。變應(yīng)原的實例包括 但不限于花粉變應(yīng)原提取物，由節(jié)肢動物得到的變應(yīng)原提取物，由食物或食物產(chǎn)品得到的 變應(yīng)原提取物，在昆蟲的唾液、爪或刺上存在的成分(在受試對象中會誘導(dǎo)敏感反應(yīng))等。因 此，可W使用花粉蛋白質(zhì)提取物，例如禾本科花粉（多年生黑麥草化olium perenne)，草地 早熟禾(Poa pratense),梯牧草（Phleum pratense),狗牙根（切nodon dactylon),高羊茅 草地早熟禾（Festuca pratensis),喜馬拉雅鴨茅（Dactylis glomerata),黑麥（Secale cereale),大麥（Hordeum vulgare),燕麥（Avena sativa) ,Triticum sativa)，其他草花粉 (例如艾草（Al" temisia vulgaris),襲（加 enopodium album),長葉車前（Plantago Ianceolata),蒲公英茵香（Taraxacum vulgare) ,Parietaria judaica,刺沙蓬（Salsola kali),異株等麻(U;rtica dioica))，或者樹花粉(例如橄攬(Olea europaea),懸鈴木屬， Cuppresus SPP)等。此外，還可W使用由節(jié)肢動物得到的蛋白質(zhì)提取物，例如塵蛾(例如歐 妍怪塵蛾（Dermstophsgoides pteronyssinus),美妍|塵蛾（Dermstophsgoides f曰rin曰e), Acaro siro,Blomia tropicalis,梅氏嗜霉蛾化 uroglyphus maynei),家甜食蛾 (Glyciphagus domesticus),害嗜鱗蛾化epidoglyphus destructor),腐食酸蛾 (Tyrophagus PUtrescentiae))等。其他變應(yīng)原提取物可W得自真菌抱子(煙草赤星病菌 (Alternaria alternate),蠟葉芽枝霉（Cladosporium herbarum),特異青霉（Penicilium notatum))和動物上皮細胞(狗上皮細胞、貓上皮細胞、馬上皮細胞、羽毛混合物），W及得自 食物成分等。如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所理解的那樣，皮膚和皮膚上的附屬物(例如頭發(fā))包含在 術(shù)語"上皮細胞"內(nèi)。實際上，任何變應(yīng)原都可W用于免疫原性復(fù)合物中，然而，在具體的實 施方案中，變應(yīng)原選自花粉、充滿、上皮細胞、真菌抱子和它們的組合。
[0024] 在另一個具體的實施方案中，得自物種梯牧草，喜馬拉雅鴨茅，狗牙根，多年生黑 麥草，S毛草屬，橄攬，Cuppresus spp.，豚草屬，枠木屬，懸鈴木屬，歐棲（Corylus avellana)或歐洲檔木(Alnus glutinosa)。
[0025] 在另一個具體的實施方案中，蟲蛾術(shù)語物種歐洲室塵蛾，美洲塵蛾或Blomia tropicalis。
[00%]在另一個具體的實施方案中，上皮細胞屬于物種化Iis domesticus或家犬(Canis familiaris)。
[0027] 在另一個具體的實施方案中，真菌抱子屬于物種煙草赤星病菌或細鏈格抱 (Alternaria tenuis)。
[0028] 在本發(fā)明中，"甘露聚糖"是指碳水化合物聚合物，其由甘露糖和W下類型的糖巧 鍵組成:a-1，6-糖巧，a-1，2-糖巧，a-1，3-糖巧或0-1，3-糖巧。甘露糖是指由6個碳原子形成 的單一的糖或單糖，并且其功能化學(xué)基團在碳1或異頭碳中為醒。甘露聚糖可W包含得自甘 露糖蛋白的膚殘基（其與甘露糖蛋白天然結(jié)合）。任何甘露聚糖都可W用于本發(fā)明的內(nèi)容 中。甘露聚糖的實例包括但不限于聚甘露糖，半乳甘露聚糖，葡萄甘露聚糖，乙酷化甘露聚 糖和蘆苔多糖(aloeride)。
[0029] 甘露聚糖可W理解為甘露糖通過Q-D-(I^e)鍵結(jié)合而形成的線性結(jié)構(gòu)，其具有主 要通過a-D-(1^2)鍵(而且還通過a-D-(1^3)鍵)形成的不同單元的常見的短的支鏈。
[0030] "半乳甘露聚糖"可W理解為甘露糖鏈彼此通過0(1^4)鍵結(jié)合而形成的化合物， 在多數(shù)情況下，其具有半乳糖單元通過0(1^6)鍵與甘露糖結(jié)合而形成的支鏈。根據(jù)提取半 乳甘露聚糖的植物，半乳甘露聚糖具有不同的支化程度。
[0031] "葡萄甘露聚糖"應(yīng)該理解為W下化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通過e(i^4)鍵連接的比例 分別為8: 5的D-甘露糖和D-葡萄糖。例如葡萄甘露聚糖在植物魔芋（Amorphophal Ius konjac)的塊莖中發(fā)現(xiàn)。
[0032] "乙酷化甘露聚糖"應(yīng)該理解為(6(1-4)-甘露聚糖型的0-乙酷化復(fù)合多糖的混合 物。例如乙酷化甘露聚糖在植物(Aloe vera)中發(fā)現(xiàn)。
[0033] "蘆苔多糖"可W理解為由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖構(gòu)成的具有高分子 量的多糖。例如蘆苔多糖在植物真蘆苔中發(fā)現(xiàn)。
[0034] 甘露聚糖(聚甘露糖，半乳甘露聚糖，葡萄甘露聚糖等)可W得自天然來源，例如得 自真菌、酵母菌和植物，或者使用本領(lǐng)域的專業(yè)人員普遍已知的技術(shù)通過化學(xué)合成而獲得。 在具體的實施方案中，作為本發(fā)明的免疫原性復(fù)合物的一部分的甘露聚糖得自酵母菌、植 物或真菌。在另一個具體的實施方案中，酵母菌選自酵母屬、畢赤酵母屬和假絲酵母屬。 [00巧]酵母屬的實例。酵母菌包括但不限于S. bayanus ,布拉迪酵母（S. boulardii ), S . bulderi , S . cariocanus , S . cariocus ,酉良酒酉奉母（S . cerevisiae) , S. cheval ieri , S.d曰irenensis,S. elIipsoideus,S.eub曰y曰nus,S.exiguus,S.fIorentinus,S.kluyveri, S . martiniae , S . monacensis ,S.norbensis,奇異酉奉母（S. paradoxus ),己其if 德酉奉母 (S.P曰Stori曰nus),S.spencerorum,S.turicensis,S.unisporus,S.UV曰rum和S.zon曰tus。在 更具體的實施方案中，酵母菌為釀酒酵母。