Tspan 33是用于治療b細(xì)胞霍奇金淋巴瘤的抗體靶向療法的候選物的制作方法
【專利說明】TSPAN 33是用于治療B細(xì)胞霍奇金淋己瘤的抗體祀向療法的 候選物
[0001] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明
[0002] 本發(fā)明是在政府支持下根據(jù)美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)的資助號(hào)R21 AI096278做出的。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[000引背景
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明設(shè)及在活化的B細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)TSPAN33。
【背景技術(shù)】
[0005] B細(xì)胞是協(xié)調(diào)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的體液反應(yīng)的淋己細(xì)胞(1)。不同于在胸腺中成熟的 T細(xì)胞，B細(xì)胞在骨髓中產(chǎn)生，其中它們成熟而成為成熟的初始B細(xì)胞（1)。8細(xì)胞僅負(fù)責(zé)分泌 識(shí)別外來抗原的抗體或在自身免疫性疾病的情況下分泌自身抗原?？贵w分為多種亞型，運(yùn) 些亞型決定了它們的位置和功能運(yùn)兩者，如參與保護(hù)粘膜表面的IgA。某些類型的淋己瘤具 有B細(xì)胞起源。B細(xì)胞淋己瘤在歷史上已經(jīng)被分成兩種主要的類型：霍奇金淋己瘤化Odgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋己瘤（NHL)。W托馬斯霍奇金（Thomas Hodgkin)命名并且在 1832年被首次描述(2)的霍奇金氏淋己瘤的特征在于存在李-施二氏細(xì)胞(Reed Sternberg cell)、脾、淋己結(jié)或身體其他免疫組織的腫大，W及可W波及到淋己組織W外的異常生長(zhǎng)。 術(shù)語'非霍奇金氏淋己瘤'已經(jīng)被用于描述不伴有標(biāo)志性化癥狀的所有類型的淋己瘤?，F(xiàn)行 的淋己瘤分類已經(jīng)將化或NHL分組體系替代為在4大類中含有80種類型的分組體系（2)。本 發(fā)明的一些實(shí)施方案設(shè)及使用在活化B細(xì)胞的膜或B細(xì)胞淋己瘤中表達(dá)的新穎生物標(biāo)志物 來鑒定特定的病變B細(xì)胞或?qū)崿F(xiàn)對(duì)表達(dá)也被稱為BAAM抗原的四旋蛋白33 (TSPAN33)的病變B 細(xì)胞或T細(xì)胞淋己瘤的特異性消除，運(yùn)是因?yàn)橐阎恍㏕細(xì)胞淋己瘤異常地表達(dá)B細(xì)胞抗原， 如CD20(3)。因此，使用BAAM作為治療性祀標(biāo)不受淋己瘤類型的限制，但是受到在淋己細(xì)胞 的表面上由TSPAN33/BAAM基因編碼的蛋白質(zhì)的存在所限制。
[0006] 癌癥免疫療法已經(jīng)由于治療性單克隆抗體的發(fā)展而發(fā)生轉(zhuǎn)變。運(yùn)些抗體祀向在腫 瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)的細(xì)胞表面分子。存在允許同時(shí)對(duì)數(shù)千種基因的表達(dá)進(jìn)行集體篩選的 技術(shù)，如基因陣列。生物信息學(xué)的應(yīng)用允許對(duì)基因陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析W鑒定編碼細(xì)胞表面 蛋白的基因，運(yùn)些細(xì)胞表面蛋白代表了用于研發(fā)單克隆抗體的祀標(biāo)。然后運(yùn)些抗體可W被 用作治療劑W減緩腫瘤生長(zhǎng)或直接殺滅腫瘤細(xì)胞?？贵w祀向療法已經(jīng)日益普及，運(yùn)是因?yàn)?保羅?歐立希(Paul化rlich)最初在1908年將抗體設(shè)想為可W向微生物或腫瘤遞送毒素 的"魔術(shù)彈(magic bullet)" (4)。在1981年，Gaf far ,S.A.等（5)使用針對(duì)人類癌胚抗原 (CEA)的放射性標(biāo)記的抗體W可能經(jīng)由誘導(dǎo)DNA損傷來向人類結(jié)腸癌異種移植物遞送特異 性細(xì)胞毒性。在1988年，DeNardo等(6)報(bào)道了 10名患有B細(xì)胞惡性腫瘤的患者中有4名在接 受放射性標(biāo)記的抗體祀向療法的施用后完全或部分緩解。不久之后，其他人已經(jīng)報(bào)道了 "裸"（未標(biāo)記的)抗體經(jīng)由補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CMC)或抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的類似 的抗腫瘤活性(7)。
[0007] 治療性抗體與祀分子結(jié)合可W觸發(fā)通常由該祀分子控制的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。運(yùn)可W 弓植腫瘤細(xì)胞命運(yùn)的改變。它可W引起細(xì)胞調(diào)亡、壞死、細(xì)胞周期停滯、增強(qiáng)的增殖、或分 化。運(yùn)些發(fā)生改變的細(xì)胞行為中的一些在癌細(xì)胞的情況下是理想的，特別是引起細(xì)胞死亡 或增殖停滯的那些(壞死、細(xì)胞調(diào)亡）。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W確定給定的抗體是否在腫瘤細(xì) 胞中誘導(dǎo)運(yùn)些效應(yīng)中的任一種(8-9)。
[0008] 由小鼠細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體需要'人源化' W降低它們的免疫原性W用于人類 中。存在多種實(shí)現(xiàn)運(yùn)樣的方式。一種是通過產(chǎn)生人源化抗體，其中抗體的小鼠區(qū)域(可結(jié)晶 片段或化)被人類化序列置換(9)。運(yùn)可W使用多種分子生物學(xué)技術(shù)來完成(8-9)。或者，可 通過對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫接種來產(chǎn)生抗體，所述轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫系統(tǒng)已經(jīng)通過使用分 子生物學(xué)技術(shù)用人類免疫球蛋白基因置換小鼠免疫球蛋白基因而被改變。已經(jīng)產(chǎn)生了多種 運(yùn)樣的小鼠（7)。
[0009] 鑒于上述可能性，治療性單克隆抗體已經(jīng)變成治療各種癌癥的優(yōu)選方法（10)?；?于FDA批準(zhǔn)的抗體的療法，如利妥昔單抗(rituximabK-種抗CD20抗體)已經(jīng)被用于治療非 霍奇金氏淋己瘤(NHL) W及自身免疫性病癥，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(Il)D因此，針對(duì)在疾 病細(xì)胞/組織上表達(dá)的獨(dú)特的生物標(biāo)志物的抗體祀向療法已經(jīng)被證實(shí)有效治療人類癌癥或 自身免疫性病癥。其他實(shí)例包括赫賽汀化erceptin)，即一種祀向乳腺癌細(xì)胞中的化r-2抗 原的人源化單克隆抗體（12);或阿瓦斯汀(Avastin),即一種祀向結(jié)腸直腸癌的血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子的人源化抗體(13)。運(yùn)些實(shí)例代表了在某些人類癌癥中具有顯著的（積極的）治療作 用的非常成功的抗體。
[0010] 祀向B細(xì)胞的抗體已經(jīng)被證實(shí)在治療上是重要的，運(yùn)是因?yàn)樵S多淋己瘤和白血病 表達(dá)B細(xì)胞抗原（11)。一個(gè)實(shí)例是利妥昔單抗（14)，即一種祀向CD20的治療性抗體，所述 CD20是在某些人類淋己瘤中表達(dá)的蛋白質(zhì)。然而，正常的B細(xì)胞也表達(dá)CD20,因此盡管祀向 CD20的抗體療法消除了大部分的腫瘤細(xì)胞，但是運(yùn)種治療也除去了它們也表達(dá)CD20的正常 B細(xì)胞（15)。運(yùn)是在人類中施用利妥昔單抗的嚴(yán)重副作用。盡管如此，消除腫瘤細(xì)胞的益處 仍證明在患有CD20陽性淋己瘤的患者中使用利妥昔單抗是合理的（11)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 在一個(gè)方面，提供了一種治療其中TSPAN33上調(diào)的淋己瘤或白血病的方法。所述方 法包括向需要運(yùn)種治療的患者施用有效治療淋己瘤或白血病的量的抗TSPAN33抗體。
[001引在所述方法中：
[0013] a)所述淋己瘤可為霍奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、前體T細(xì)胞白血病/淋己瘤、濾 泡性淋己瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋己瘤、套細(xì)胞淋己瘤、B細(xì)胞慢性淋己細(xì)胞性白血病/淋己瘤、 MALT淋己瘤、伯基特氏淋己瘤(Burkitt'S lymphoma)、伯基特氏淋己瘤、非特指性外周T細(xì) 胞淋己瘤（peripheral T-cell Iymphoma-Not-Otherwise-Specifie d)、霍奇金淋己瘤的 結(jié)節(jié)硬化形式、或霍奇金淋己瘤的混合細(xì)胞亞型；
[0014] b)所述淋己瘤可為霍奇金淋己瘤或非霍奇金淋己瘤；
[0015] C)所述施用可W引起患者的TSPAN33+B細(xì)胞的數(shù)目減少；
[0016] d)所述抗TSPAN33抗體可為單克隆抗體、中和抗體、或人源化抗體、或其組合;或
[0017] e)a-d 的組合。
[0018] 在另一個(gè)方面，提供了 一種治療其中TSPAN33上調(diào)的免疫性疾病的方法。所述方法 包括向需要運(yùn)種治療的患者施用有效治療免疫性疾病的量的抗TSPAN33抗體。
[0019] 在所述方法中：
[0020] a)所述免疫性疾病可為過敏或自身免疫性疾?。?br>[0021 ] b)所述疾病可為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、舍格倫綜合征(Sjogren'S syndrome)、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏?。–rohn's disease)、硬皮病、過敏性肺炎、自身免疫性甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎化ashimoto thyroiditis)、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、強(qiáng)直性脊柱炎、乳糜瀉、特發(fā)性血小板減 少性紫齋、混合型結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、多發(fā)性骨髓瘤、尋常天瘤瘡、顛動(dòng)脈炎、白斑病、 或全身性紅斑狼瘡；
[0022] C)所述疾病可為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或全身性紅斑狼瘡；
[0023] d)所述施用可W引起患者的TSPAN33+B細(xì)胞的數(shù)目減少；
[0024] e)所述抗TSPAN33抗體可為單克隆抗體、中和抗體、或人源化抗體、或其組合;或 [00巧]f)a-e的任何組合。
[0026] 在另一個(gè)方面，提供了一種將活化的B淋己細(xì)胞純化的方法。所述方法包括將抗 TSPAN33抗體與含有淋己細(xì)胞的細(xì)胞制備物混合，W及分離由所述抗體結(jié)合的淋己細(xì)胞。在 所述方法中，所述抗TSPAN33抗體可為單克隆抗體、中和抗體、或人源化抗體、或其組合;和/ 或所述分離可通過巧光活化細(xì)胞分選來進(jìn)行。
[0027] 在另一個(gè)方面，提供了一種鑒定活化和/或病變的B淋己細(xì)胞的方法。所述方法包 括檢測(cè)淋己細(xì)胞中TSPAN33的表達(dá)上調(diào)。
[002引在所述方法中：
[0029] a)所述檢測(cè)可W包括:將抗TSPAN33抗體添加到包含所述淋己細(xì)胞的蛋白質(zhì)的樣 品中；當(dāng)在所述樣品中存在TSPAN33時(shí)所述抗體與TSPAN33之間形成免疫復(fù)合物；W及檢測(cè) 所述免疫復(fù)合物；
[0030] b)所述檢測(cè)可W包括：由所述淋己細(xì)胞的RNA制備CDNA;使用對(duì)TSPAN33基因中的 核巧酸序列具有特異性的引物擴(kuò)增所述CDNA，或使所述CDNA與TSPAN33基因的核巧酸序列 雜交；W及檢測(cè)所述擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物或檢測(cè)所述CDNA與TSPAN33核巧酸序列之間的雜 交體；
[0031] C)所述淋己細(xì)胞可W來自于患者，并且所述方法還可W包括當(dāng)檢測(cè)到TSPAN33的 表達(dá)上調(diào)時(shí)向所述患者施用抗TSPAN33抗體;或
[0032] d)a)和C)、或b)和C)的任何組合。
[0033] 在另一個(gè)方面，提供了一種對(duì)設(shè)及活化和/或病變的B淋己細(xì)胞的淋己瘤或免疫性 疾病進(jìn)行診斷的方法。所述方法包括針對(duì)活化和/或病變的B淋己細(xì)胞的存在分析患者的樣 品，運(yùn)是通過檢測(cè)所述樣品的淋己細(xì)胞中TSPAN33的表達(dá)上調(diào)來進(jìn)行，當(dāng)檢測(cè)到活化和/或 病變的B淋己細(xì)胞時(shí)，將所述患者診斷為患有所述淋己瘤或免疫性疾病。
[0034] 在所述方法中：
[0035] a)所述疾病可為霍奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、前體T細(xì)胞白血病/淋己瘤、濾泡 性淋己瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋己瘤、套細(xì)胞淋己瘤、B細(xì)胞慢性淋己細(xì)胞性白血病/淋己瘤、 MALT淋己瘤、伯基特氏淋己瘤、伯基特氏淋己瘤、非特指性外周T細(xì)胞淋己瘤、霍奇金淋己瘤 的結(jié)節(jié)硬化形式、或霍奇金淋己瘤的混合細(xì)胞亞型；
[0036] b)所述疾病可為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、舍格倫綜合征、自身免疫 性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、硬皮病、過敏性肺炎、自身免疫 性甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯氏病、強(qiáng)直性脊柱炎、乳糜瀉、特發(fā)性血小板減少性 紫齋、混合型結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、多發(fā)性骨髓瘤、尋常天瘤瘡、顛動(dòng)脈炎、白斑病、或全 身性紅斑狼瘡；
[0037] C)所述疾病可為霍奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或全身性紅斑 狼瘡；
[0038] d)檢測(cè)所述樣品的淋己細(xì)胞中TSPAN33的表達(dá)上調(diào)可通過本文所述的檢測(cè) TSPAN33表達(dá)上調(diào)的任何方法來進(jìn)行。
【附圖說明】
[0039] 為了更完全了解本發(fā)明，現(xiàn)在結(jié)合附圖參考W下說明，在附圖中：
[0040] 圖1是人類TSPAN33的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)。
[0041 ]圖2是人類TSPAN33(SEQIDN0:1)和小鼠 TSPAN33(SEQIDN0:2)的氨基酸序列 比較。還示出了共有序列（SEQ ID N0:3)。
[0042] 圖3是示出了在正常人類組織中TSPAN33表達(dá)限于活化的B細(xì)胞的圖表。由基因表 達(dá)的人體指數(shù)化uman body index)數(shù)據(jù)庫匯編的Affymetrix基因陣列化133 plus 2.0)數(shù) 據(jù)觀測(cè)到TSPAN33在正常的人類組織(n = 8)和免疫細(xì)胞中的表達(dá)。X軸由器官系統(tǒng)構(gòu)成:CNS (中樞神經(jīng)系統(tǒng)）、Gut(胃腸系統(tǒng)）、Struct(結(jié)構(gòu)系統(tǒng)）、Vasc(脈管系統(tǒng)）、Resp(呼吸系統(tǒng)）、 Endo(內(nèi)分泌系統(tǒng)）、Ur(泌尿系統(tǒng)）、Rep(生殖系統(tǒng)）、Imm_T(免疫組織）、Imm_C(免疫細(xì)胞）、 W及Dev(發(fā)育系統(tǒng)）。
[0043] 圖4是示出了在小鼠和人類中TSPAN33表達(dá)限于活化的B細(xì)胞的圖。4A)與人類骨髓 相比，由人類血液純化的休止的和活化的（抗CD40+化-4)人類B淋己細(xì)胞中TSPAN33表達(dá)的 qRT-PCR(n = 3)D4B)使用肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照，在休止?fàn)顟B(tài)和活化狀態(tài)(使用CpG+美洲商 陸有絲分裂原(PWM)+pansorbin)下PBMC的TSPAN33表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡。還示出了光密度分 析。4C)在人類沈2 B細(xì)胞（黑色條柱）中在抗CD40 mAb+IL-4刺激下W及在人類化rkat T細(xì) 胞（白色條柱）中在未刺激、抗CD3+抗CD28 mAb、或PMA+離子霉素（ionomyCin)刺激下在12小 時(shí)內(nèi)隨時(shí)間推移TSPAN33表達(dá)的9削斗〔3，11 = 3。40)休止的人類262 6細(xì)胞相比于使用抗 CD40mAb+IL-4活化的人類沈2 B細(xì)胞中TSPAN33表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡。還示出了光密度分析。 4E)在休止?fàn)顟B(tài)W及使用0.1、1或10 ng/mL的LPS+比-4的活化狀態(tài)下Tspan33 A20-2J B細(xì) 胞的qRT-PCRd4F)由C57BL/6脾臟富集的休止的B細(xì)胞或被刺激(使用10 ng/mL的LPS+a-4) 12小時(shí)的B細(xì)胞的qRT-PCR，n = 3，*p<0.05，林p<0.01 W及***p<0.001表示根據(jù)斯氏t檢 驗(yàn)（Student's t test)具有統(tǒng)計(jì)顯著性。數(shù)據(jù)代表S次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD)。
[0044] 圖5是示出了 TSPAN33在人類霍奇金氏淋己瘤和非霍奇金氏淋己瘤中表達(dá)的圖。 5A)對(duì)多種人類NHL細(xì)胞系進(jìn)行qRT-PCR并且測(cè)量TSPAN33(黑色條柱)相比于MS4A1/CD20(白 色條柱)表達(dá)。針對(duì)GAPD聞尋樣品歸一化。5B)與GAPDH相比，在人類伯基特氏淋己瘤細(xì)胞系 尺曰扣、3曰111〇3^及化11山中相對(duì)于在8曰。3(-種小鼠祖8細(xì)胞系）中對(duì)應(yīng)于15口4肥3的大細(xì)胞外 環(huán)區(qū)33 (LEL)的RT-PCR表達(dá)分析。5C)使用兔抗TSPAN33多克隆抗體對(duì)Ra j i、Ramo S、Daud i、W 及BaF3細(xì)胞的TSPAN33表達(dá)進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析。數(shù)據(jù)代表S次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[004引圖6是示出了 TSPAN33在人類淋己瘤中表達(dá)的一組圖像。將淋己瘤活檢切片并且使 用蘇木精/伊紅和抗TSPAN33抗體染色，繼而使用同種型或抗兔IgG-HRP染色。白色箭頭指示 李-施二氏細(xì)胞并且黑色箭頭指示TSPAN33染色呈陽性的細(xì)胞。取自被診斷患有化(n = 6)、 DLB化(n = 6) W及套細(xì)胞淋己瘤(n = 2)的患者的活檢的代表性圖像。
[0046] 圖7是示出了 TSPAN33在B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫中上調(diào)的圖。7A)針對(duì)CD19表達(dá)歸一 化的取自MRL/hslpVlpr小鼠的總脾細(xì)胞的Tspan33表達(dá)的qRT-PCR。比較9周大(無可檢測(cè) 出的病變）、24周大(伴有或不伴有輕度耳部病變的淋己結(jié)?。￤及36周大(伴有耳部和面部 病變的淋己結(jié)?。┑男∈蟮?39曰1133表達(dá)，11 = 5。78)來自11.5周大的雌性(淋己結(jié)病)和12.5 周大的雄性（無病變)MRL/faslpr/lpr小鼠的CD19+CD138-和CD19-CD138+脾細(xì)胞中Tspan33 表達(dá)的qRT-PCR，n = 2。7C)對(duì)來自人類化E患者或健康對(duì)照的PBMC進(jìn)行的TSPAN33表達(dá)分析 的qRT-PCR，n = 9D7D)對(duì)來自健康人和RA患者的滑膜中TSPAN33表達(dá)相比于MS4A1/CD20表達(dá) 的微陣列分析。如所述化.Soto ,P.胎vezi ,R. B.Roth ,A. Pahuja,D. Alleva,H.M. Acosta, C.Martinez ,A.Ortega,A.Lopez,R.Araiza-Casillas,A.Zlotnik,Gene array analysis comparison between rat collagen-induced arthritis and human rheumatoid arthritis，Scand J Immunol ,68(2008)43-57)，從對(duì)照或RA患者分離滑膜。將RNA從膜中分 離并且使用Affymetrix基因陣列U133 plus 2.0分析MS4A1/CD20和TSPAN33表達(dá)，健康人的 n = 9并且RA患者的n = 5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(斯氏t檢驗(yàn)）。數(shù)據(jù)代表至少S 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(A-C)。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。
[0047] 圖8是示出了 TSPAN33在近曲小管、遠(yuǎn)曲小管W及集合管中表達(dá)，但不在腎臟腎小 球中表達(dá)的一組圖像。對(duì)腎臟活檢進(jìn)行染色W在組織陣列中進(jìn)行IHC。將樣品用蘇木精/伊 紅和抗TSPAN33或兔IgG同種型對(duì)照染色，繼而用抗兔IgG-HRP染色。8A)示出了淋己細(xì)胞(黑 色箭頭）和神經(jīng)（白色箭頭）的40倍放大圖。8B)示出了近曲小管（黑色箭頭）和腎臟腎小球 (白色箭頭）的40倍放大圖。8C)示出了遠(yuǎn)曲小管（黑色箭頭)和集合管（白色箭頭）的40倍放 大圖。8D)示出了頂面(黑色箭頭)和顆粒（白色箭頭)的近曲小管的100倍放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 要求2012年12月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/740，946的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)申請(qǐng)于 W引用的方式并入本文。
[0049] 四旋蛋白33是膜蛋白的四旋蛋白家族的成員（16)并且被定位到人類染色體7 (7q31.2-q32) (17)，即為骨髓發(fā)育異常綜合征和急性骨髓性白血病中缺失的熱點(diǎn)的區(qū)域 (17)。四旋蛋白33最初被表征為設(shè)及紅細(xì)胞生成的新四旋蛋白（17-18)。
[0050] 四旋蛋白33還被命名為Penumbra,即Pen(17)(對(duì)于原成紅細(xì)胞 (町〇斟Tthrob 1 ast)些(新)膜(membrane ))，運(yùn)是因?yàn)閹в谢痭基因祀向缺失的小鼠（Perf/-) /%^半有貧血和脾品去的異常^夫品嗜堿性1?(：(18)。在小鼠的骨髓中，在包括所有的成紅 細(xì)胞的TER119+部分當(dāng)中發(fā)現(xiàn)最高的化numbra表達(dá)，而在中性粒細(xì)胞、休止的T細(xì)胞、休止的 B細(xì)胞、單核細(xì)胞、或自然殺傷細(xì)胞中，Penumbra表達(dá)是低的或不可檢出的（18)。盡管該后一 項(xiàng)的研究發(fā)現(xiàn)TER119+B細(xì)胞是骨髓中最高表達(dá)Tspan33的細(xì)胞，但本文所包括的我們自己 的數(shù)據(jù)表明活化B細(xì)胞中四旋蛋白33的表達(dá)是總骨髓中表達(dá)的40倍。后者的觀測(cè)結(jié)果引導(dǎo) 我們得出結(jié)論，即活化的B細(xì)胞代表了在人體內(nèi)具有最高的Tspan33/BAAM表達(dá)的細(xì)胞。運(yùn)使 得Tspan33/BAAM成為一種作為治療性抗體研發(fā)的祀標(biāo)的獨(dú)特的候選物W治療淋己瘤或某 些人類自身免疫性疾病，其中B細(xì)胞設(shè)及它們的發(fā)病。
[0051] 人類四旋蛋白33(由TSPAN33編碼）已經(jīng)使用超過90種不同的組織和器官的基因表 達(dá)譜的綜合數(shù)據(jù)庫(基因表達(dá)的身體指數(shù))被鑒定為一種存在于B細(xì)胞淋己瘤上的生物標(biāo)志 物（19)。人類四旋蛋白33是與鼠類四旋蛋白33具有97%同源性的四跨膜蛋白超家族的成員 并且設(shè)及造血作用（18)。小鼠 BAAM基因與人類BAAM基因之間的高度保守性使得小鼠模型適 用于設(shè)及抗體祀向療法的臨床前研究。
[0052] 人類四旋蛋白33蛋白質(zhì)序列提供于圖1中。人類TSPAN33蛋白質(zhì)相比于小鼠 TSPAN33蛋白質(zhì)的比對(duì)示于圖2中。人類TSPAN33核巧酸序列的登錄號(hào)是NM_178562(W引用 的方式并入本文），而人類TSPAN33蛋白質(zhì)序列的登錄號(hào)是NP_848657(W引用的方式并入本 文)。
[0053] 已經(jīng)使用基因表達(dá)的綜合數(shù)據(jù)庫（基因表達(dá)的身體指數(shù):BIGE(19))在人體的105 種組織和細(xì)胞中對(duì)Tspan33的表達(dá)進(jìn)行定位。BIGE數(shù)據(jù)庫表明Tspan 33的表達(dá)具有高度特 異性并且最高水平的表達(dá)在活化的B細(xì)胞中（圖3)。本申請(qǐng)的發(fā)明人因此決定將運(yùn)種分子重 親if命名為BAAM或B細(xì)胞活化相關(guān)分子(B cell心tivation Associated心Iecule)，運(yùn)個(gè)名 稱更好地反映了-它在人類中的表達(dá)接式。具W顯著水平的^AAM表達(dá)的^一個(gè)部位是腎臟 (圖3)。使用人類RNA的qRT-PCR確認(rèn)了BAAM表達(dá)的運(yùn)種模式（圖4)，在腎臟中檢測(cè)到高水平 的BAAM mRNA。包括一級(jí)淋己器官（骨髓和胸腺)和二級(jí)淋己器官(脾臟)在內(nèi)的所有其他組 織W及休止的B細(xì)胞的BAAM表達(dá)呈陰性。
[0054] 在BAAM表達(dá)的淋己外部位當(dāng)中，在腎臟中的表達(dá)引起了對(duì)在體內(nèi)可能治療性使用 抗BAAM抗體的擅化。為了評(píng)估針對(duì)BAAM的治療性單克隆抗體在腎臟中脫祀部位祀向的可能 性，使用抗BAAM多克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)（圖8)。運(yùn)些結(jié)果掲示BAAM在腎臟的近曲小管 和遠(yuǎn)曲小管中表達(dá)，而淋己細(xì)胞、神經(jīng)、腎臟集合管W及腎小球不表達(dá)BAAM。近曲小管和遠(yuǎn) 曲小管襯有上皮刷狀緣細(xì)胞，運(yùn)些細(xì)胞設(shè)及在尿液濾過期間分泌和吸收蛋白質(zhì)、離子W及 有機(jī)溶質(zhì)。BAAM在腎臟中的表達(dá)因此與B細(xì)胞活化無關(guān)并且可能設(shè)及運(yùn)些細(xì)胞中的囊泡運(yùn) 輸或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，運(yùn)是因?yàn)樗男鞍鬃鳛橐粋€(gè)家族已經(jīng)與運(yùn)些功能相關(guān)聯(lián)（16)。重要的是，只 有低分子量的蛋白質(zhì)可W從血流的輸入血管穿過腎小球囊腔并且進(jìn)入曲小管中，其中尿液 將被集合W轉(zhuǎn)移至膀脫中。因此，祀向BAAM的治療性單克隆抗體應(yīng)當(dāng)不會(huì)觸及到它們的祀 標(biāo)并且影響腎臟功能，運(yùn)是因?yàn)榭贵w不會(huì)進(jìn)入運(yùn)個(gè)囊腔中。此外，已經(jīng)報(bào)道，腎臟上皮細(xì)胞 對(duì)于基于生物的細(xì)胞毒性劑是無感受性的并且還據(jù)報(bào)道，腎細(xì)胞癌對(duì)ADCC具有抗性(20)。 綜上所述，運(yùn)些數(shù)據(jù)表明T