Egf配體靶向納米載藥體系及其抗腫瘤治療應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物納米載藥材料及藥物靶向運(yùn)輸領(lǐng)域，具體涉及一種表皮生長(zhǎng)因子配體靶向納米載藥體系及其抗腫瘤治療應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤(癌癥)是危害人類健康、威脅人類生命的第一殺手，具有發(fā)病率高、死亡率高、治療困難及易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新《世界癌癥報(bào)告》，2012年全球有1400萬(wàn)新增癌癥病例，癌癥死亡人數(shù)達(dá)820萬(wàn)。我國(guó)新診斷癌癥病例為307萬(wàn)，占全球總數(shù)的21.8%，癌癥死亡人數(shù)約220萬(wàn)，占全球癌癥死亡人數(shù)的26.9%。而且根據(jù)目前的癌癥發(fā)病趨勢(shì)，到2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50%。因此，腫瘤治療面臨更加艱巨的任務(wù)，而目前化療作為腫瘤主要治療手段之一，由于缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也破壞了正常組織細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的毒副作用。因此，發(fā)展一種引導(dǎo)抗腫瘤藥物靶向輸送至“病灶”部位、并提高靶區(qū)藥物濃度的藥物載體顯得尤為迫切。
[0003]隨著納米技術(shù)在腫瘤生物學(xué)研究中的不斷深入，磁性納米顆粒(MNPs)因具有良好的生物相容性、低毒性、表面易功能化以及獨(dú)特的超順磁性等特點(diǎn)，為腫瘤研究提供了一種新穎、頗具前景的研究材料，以功能化磁性納米顆粒作為載體、靶向輸送抗腫瘤藥物成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。羧甲基殼聚糖(CMC)是殼聚糖經(jīng)過(guò)羧基化反應(yīng)后生成的一種水溶性衍生物，具有良好的穩(wěn)定性、組織及血液相容性、可降解性以及有效的膜穿透性等特性。由于它是一種含有活性氨基、羧基的兩親性可降解性多糖，可與多種生物活性物偶聯(lián)，因而成為新一代藥物載體優(yōu)選的包被材料。通過(guò)在磁性納米顆粒(MNPs)表面包被羧甲基殼聚糖(CMC)可以提高載體的分散穩(wěn)定性、相容性及水溶性。
[0004]功能化磁性納米顆粒作為給藥載體可克服傳統(tǒng)給藥方式所帶來(lái)的缺陷，如藥物隨著載體被輸送至靶區(qū)(腫瘤部位)周圍使靶區(qū)很快達(dá)到所需濃度，因此可降低給藥劑量，減少藥物降解，提高藥物穩(wěn)定性及生物利用度、延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋和控釋等，將成為腫瘤治療的主導(dǎo)。但是，目前該領(lǐng)域仍然存在許多技術(shù)瓶頸問(wèn)題尚待解決:治療性藥物面臨著如何被特異和有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到靶(腫瘤)細(xì)胞的難題;載體能否將藥物安全有效地運(yùn)輸?shù)街付ú课?、轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞并在胞質(zhì)中發(fā)揮作用;如何改善載體表面性質(zhì)，以避免載體被肝、脾、肺、骨髓等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬；如何提高載體的載藥量等。針對(duì)上述問(wèn)題，靶向功能化磁納米載體為抗腫瘤藥物的靶向運(yùn)輸提供了一個(gè)新的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前抗腫瘤藥物靶向輸送困難、易降解及體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短等腫瘤治療中迫切需要解決的問(wèn)題，構(gòu)建一種具有配體特異性靶向功能的納米藥物輸送體系。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案為:EGF配體革El向納米載藥體系，載藥體系以超順磁性納米顆粒作為磁核，以羧甲基殼聚糖為包被材料，其中裝載抗腫瘤藥物，并在其表面修飾表皮生長(zhǎng)因子 EGF。
[0007 ]進(jìn)一步地，所述磁核為超順磁性能的四氧化三鐵納米顆粒。
[0008]進(jìn)一步地，所述抗腫瘤藥物為長(zhǎng)春新堿VCR。
[0009 ] EGF配體靶向納米載藥體系的制備方法，包括以下步驟:
①磁核的制備:利用部分還原三氯化鐵溶液共沉淀法制備四氧化三鐵納米顆粒；
②磁核包被及藥物裝載:通過(guò)反相微乳液法在四氧化三鐵納米顆粒表面包被羧甲基殼聚糖及裝載抗腫瘤藥物制備藥物-CMC/MNPs;
③EGF修飾藥物-CMC/MNPs:采用EDC活化羧基偶聯(lián)表皮生長(zhǎng)因子EGF的方法制備EGF-藥物-CMC/ MNPs0
[0010]進(jìn)一步地，EGF配體靶向納米載藥體系的制備方法，包括以下步驟:
①利用部分還原三氯化鐵(FeCl3)溶液共沉淀法，磁力攪拌條件下制備載體核四氧化三鐵納米顆粒溶液，脫氧水洗滌、真空干燥、研磨過(guò)濾即得四氧化三鐵納米顆粒；
②采用生物相容性的羧甲基殼聚糖(CMC)作為磁核包被材料，利用反相微乳液法在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，機(jī)械攪拌進(jìn)行包被和裝載抗腫瘤藥物，所得產(chǎn)物在外加磁場(chǎng)的條件下進(jìn)行磁分離洗滌，真空干燥，收集即為藥物-CMC/MNPs;
③反應(yīng)在MES溶液中進(jìn)行，加入EDC混勻后，加入EGF，振蕩反應(yīng)，所得產(chǎn)物用I3BS磁分離洗滌，即得EGF-藥物-CMC/MNPs。
[0011]進(jìn)一步地，步驟③的具體方法為:
將藥物-CMC/MNPs超聲分散于MES溶液中，pH 4.5-7.4，加入I mg/mL EDC混勻后，加入
0.5-2 mg/mL表皮生長(zhǎng)因子，高速振蕩反應(yīng)2 h，所得產(chǎn)物用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)磁分離洗滌，制備得到表皮生長(zhǎng)因子配體靶向的載藥復(fù)合物EGF-藥物-CMC/ MNPs。
[0012]主動(dòng)革E向磁性納米顆粒通過(guò)其表面偶聯(lián)特定的配體(或抗體)與革E細(xì)胞表面相應(yīng)受體特異性地結(jié)合，促進(jìn)靶細(xì)胞對(duì)治療藥物的攝入，避免被肝、脾、肺、骨髓等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細(xì)胞的吞噬，大大提高載體的特異性、靶向性及選擇性，提高藥物在腫瘤組織中的濃度。
[0013]表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是原癌基因c-erbBl在細(xì)胞膜上表達(dá)的多功能糖蛋白，能與表皮生長(zhǎng)因子(EGF)配體特異性結(jié)合。在不同分化程度的腫瘤組織中，其表達(dá)水平隨腫瘤惡性級(jí)別的增高而增高，這種表皮生長(zhǎng)因子受體差異性表達(dá)使得表皮生長(zhǎng)因子受體成為一種潛在的腫瘤靶向分子標(biāo)志物，因此，我們選擇表皮生長(zhǎng)因子配體作為修飾磁納米顆粒的靶向分子，通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體與其配體表皮生長(zhǎng)因子在細(xì)胞膜上特異性結(jié)合，構(gòu)建表皮生長(zhǎng)因子配體主動(dòng)革El向的磁納米顆粒作為抗腫瘤藥物輸送載體，提高抗腫瘤藥物的革巴向性、選擇性和聚集性。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明制備的表皮生長(zhǎng)因子(EG1靶向納米載體，具有高度的靶向選擇性，相比非靶向的納米載藥體系，顯著提高藥物的生物利用率，減少對(duì)正常組織細(xì)胞的毒副作用。
[0015]本發(fā)明納米載體和載藥體系的制備方法操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和，制備產(chǎn)物可作為抗腫瘤藥物的廣泛載體，為高效的抗腫瘤藥物靶向輸送載體研究提供了一種新的發(fā)展方向。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為EGF偶聯(lián)納米載藥體系的構(gòu)建及靶向抑制膠質(zhì)瘤增殖示意圖。
[0017]圖2為實(shí)施例1所構(gòu)建納米載藥體系的透射電子顯微鏡(TEM)圖。
[0018]圖3為實(shí)施例1EGF靶向納米載藥體系的紅外光譜(FT-1R)圖。
[0019]圖4為實(shí)施例2EGF靶向納米載藥體系的磁響應(yīng)圖。
[0020]圖5為實(shí)施例3EGF靶向納米載藥體系抑制U251細(xì)胞增殖。
[0021]圖6為實(shí)施例4EGF靶向納米載藥體系引起U251細(xì)胞活性降低。
[0022]圖7為實(shí)施例5EGF靶向納米載藥體系引起U251細(xì)胞骨架損傷。
[0023]圖8為實(shí)施例6EGF靶向納米載藥體系引起U251細(xì)胞凋亡。
[0024]圖9為實(shí)施例7EGF靶向納米載藥體系阻滯U251細(xì)胞周期進(jìn)程。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0026]實(shí)施例1
一種EGF配體靶向納米載藥體系的構(gòu)建示意圖參見(jiàn)圖1，其具體的制備步驟如下:
(I)磁核即超順磁性納米顆粒(MNPs)的制備:吸取10.5 mL去離子水于三頸燒瓶中，加入3mL2mol/L的FeCl3溶液，以適當(dāng)?shù)乃俣乳_(kāi)始磁力攪拌；勻速滴加2 mL的Na2SO3;當(dāng)顏色由紅棕色又還原為黃色時(shí)，開(kāi)始緩慢滴加80 mU^NH3.H2O溶液，并劇烈攪拌，黑色沉淀迅速生成;繼續(xù)攪拌40 min，以保證反應(yīng)完全；用脫氧水洗滌黑色沉淀3次，45°C條件下真空干燥，仔細(xì)研磨過(guò)濾即得Fe3O4粉末。
[0027](2)采用反向微乳液法制備藥物-CMC/MNPs:取適量抗腫瘤藥物、CMC及MNPs(質(zhì)量比2:1)溶于5mL的去離子水(DI)中，在氮?dú)?N2)保護(hù)下，超聲處理30 min，形成懸浮液。同時(shí)，在三口燒瓶中加入50mL液體石錯(cuò)和司盤80，在氮?dú)?N2)保護(hù)下55°水浴，600 rpm攪拌至乳狀物;然后把上述懸浮液逐滴滴加至三口燒瓶中，高速攪拌2 h，然后低速攪拌10 h，形成油包水微乳液，在外加磁場(chǎng)的條件下進(jìn)行磁分離沉淀，用石油醚，異丙醇交替洗滌三次，最后至于石油醚中，真空干燥。收集即為藥物-CMC/MNPs粉末。
[0028](3)采用EDC活化羧基偶聯(lián)EGF的方法制備EGF-藥物-CMC/MNPs:取5mgCMC/MNPs或藥物-CMC/MNPs粉末，紫外照射10 min后加入1.5 mLEP管中，再加入0.5 mLMES溶液，超聲5min，使粉末充分溶解；同時(shí)，加入20 yL EDC于上述CMC/ MNPs溶液，混合后加入5 yL的EGF，放置于ZDY-1型震蕩儀，高速震蕩反應(yīng)。用PBS磁分離洗滌，最后置于PBS，即得EGF-藥物-CMC/MNPso
[0029 ]上述實(shí)施例中的抗腫瘤藥物為長(zhǎng)春新堿(VCR )，制備的配體革El向藥物磁納米顆粒復(fù)合物為 EGF-VCR-CMC/MNPs。
[0030]將制得的載體CMC/ MNPs采用透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行表征，可觀察到圖2的現(xiàn)象。圖2表明樣品的形貌為球形或橢圓形納米顆粒，平均粒徑為±60 nm。
[0031 ] 將制得的載藥EGF-VCR-CMC/ MNPs采用紅外光譜表征產(chǎn)物的組成，可觀察到圖3的結(jié)果。圖3表明成功制備超順磁性載體核MNPs(Fe-0特征吸收峰在567.7cm—工);羧甲基殼聚糖(CMC)成功包被超順磁性載體核MNPs，抗腫瘤藥物長(zhǎng)春新堿(VCR)成功裝載、且EGF靶向修飾成功。
[0032]磁響應(yīng)性能檢測(cè):將制備的EGF-VCR-CMC/MNPs分散于DI水中，在外加磁場(chǎng)和自然狀態(tài)下，每隔一定時(shí)間(0、10、20、30、40、50、60 min)利用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)量其570 nm處透光率的變化。通過(guò)透光率數(shù)值的變化，觀察納米顆粒磁響應(yīng)能力。圖4是EGF納米載藥體系EGF-VCR-CMC/ MNPs在自