具有降低的受體介導(dǎo)的清除率的生物活性多肽單體-免疫球蛋白Fc片段綴合物以及制備 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及:包含綴合物的長(zhǎng)效藥物組合物，所述綴合物包括連接至免疫球蛋白 Fc片段的生理活性的多膚，其中組合物包含單體綴合物一一其包括連接至單個(gè)免疫球蛋白 Fc片段的一分子的生理活性的多膚，并且任選地包含多聚體綴合物一一其包括連接至單個(gè) 免疫球蛋白化片段的兩分子或更多分子的相同的生理活性的多膚，條件是組合物中單體綴 合物與多聚體綴合物的摩爾比為至少19;生理活性的多膚單體-免疫球蛋白Fc片段綴合物， 其包括經(jīng)由非膚基連接體連接至免疫球蛋白化片段的生理活性的多膚單體，其中生理活性 的多膚W單體形式經(jīng)由非膚基連接體連接至免疫球蛋白Fc片段，該綴合物與二聚體綴合 物一一其包括經(jīng)由非膚基連接體連接至單個(gè)免疫球蛋白化片段的兩分子的生理活性的多 膚，或綴合物一一其包括框內(nèi)連接至免疫球蛋白Fc片段的生理活性的多膚二聚體一一相 比，顯示了降低的受體介導(dǎo)的內(nèi)化或受體介導(dǎo)的清除率;和制備該長(zhǎng)效藥物組合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾所周知，蛋白質(zhì)在體內(nèi)通過(guò)多種機(jī)制被清除，包括通過(guò)血清蛋白酶降解、通過(guò)腎 臟消除、或通過(guò)受體清除。因此，已經(jīng)進(jìn)行了多種嘗試來(lái)避免運(yùn)樣的蛋白質(zhì)清除機(jī)制W增加 生理活性的蛋白質(zhì)的半衰期，從而增強(qiáng)它們的治療效果。具體而言，為了增加蛋白質(zhì)的半衰 期，已經(jīng)對(duì)于包括連接至蛋白質(zhì)的聚乙二醇聚合物(PEG)、白蛋白、脂肪酸或抗體化片段(恒 定區(qū)）的蛋白質(zhì)綴合物進(jìn)行了研究。運(yùn)種研究旨在將運(yùn)種物質(zhì)共價(jià)地連接至生理活性的蛋 白質(zhì)，從而增加生理活性的蛋白質(zhì)的血清半衰期并縮短藥物施用的間隔，從而增加患者的 便利。具體而言，為了穩(wěn)定蛋白質(zhì)并抑制它們與蛋白酶的接觸和它們通過(guò)腎臟的消除，使用 了將高度可溶的聚合物比如PEG化學(xué)地附著至蛋白質(zhì)藥物的表面的方法。在運(yùn)種方法的情 況下，眾所周知，聚合物非特異性地結(jié)合至祀蛋白的特異性位點(diǎn)或各個(gè)位點(diǎn)來(lái)增加蛋白質(zhì) 的溶解度，穩(wěn)定蛋白質(zhì)并阻止蛋白質(zhì)的水解，并且進(jìn)一步地，不引起具體的副作用(Sada等， JJermen^tion Bioengineering 71:137-139,1991)。然而，運(yùn)種方法存在一些問(wèn)題，因?yàn)?即使連接至生理活性的蛋白質(zhì)的PEG可W增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，但是它顯著降低了蛋白質(zhì) 的效價(jià)，并且隨著PEG分子量增加，其與蛋白質(zhì)的反應(yīng)性降低，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。此外，當(dāng)?shù)鞍?質(zhì)的特定氨基酸殘基利用脂肪酸進(jìn)行修飾時(shí)，修飾的脂肪酸可逆地結(jié)合至血清白蛋白W增 加蛋白質(zhì)的血清半衰期，但是半衰期為大約1天至1周，運(yùn)表明半衰期的增加不是非常顯著 的。此外，存在缺點(diǎn)，因?yàn)榕c白蛋白可逆地解離的生理活性的蛋白質(zhì)輕易地通過(guò)腎臟被消 除。
[0003] 由于運(yùn)些原因，已經(jīng)進(jìn)行了努力W使用免疫球蛋白片段來(lái)增加包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的 生理活性物質(zhì)的半衰期。具體而言，已經(jīng)積極地進(jìn)行了研究W通過(guò)將治療性蛋白質(zhì)與運(yùn)種 免疫球蛋白Fc片段融合來(lái)增加治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
[0004] 在哺乳動(dòng)物中通過(guò)基因重組方法將干擾素（韓國(guó)專(zhuān)利特開(kāi)公布號(hào)2003-9464)、白 介素-4受體、白介素-7受體或紅細(xì)胞生成素受體(韓國(guó)專(zhuān)利號(hào)249572)作為與免疫球蛋白Fc 片段的融合進(jìn)行表達(dá)是已知的。而且，國(guó)際專(zhuān)利公布號(hào)WO 01/03737公開(kāi)了融合蛋白，其包 括經(jīng)由寡膚連接體連接至免疫球蛋白化片段的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子。而且，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5， 116,964公開(kāi)了融合蛋白，其包括通過(guò)基因重組方法融合至免疫球蛋白化片段的氨基或簇 基末端的L皿(淋己細(xì)胞表面糖蛋白）或CD4蛋白，并且美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,349,053公開(kāi)了比-2與 免疫球蛋白化片段的融合蛋白。此外，通過(guò)基因重組方法制備的Fc融合蛋白的實(shí)例包括干 擾素-e或其衍生物與免疫球蛋白化片段的融合蛋白（國(guó)際專(zhuān)利公布號(hào)WO 00/23472)、化-5 受體與免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，712,121)、干擾素 -a與免疫球蛋白 G仲C片段的融合蛋白（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,723,125)和CD4蛋白與免疫球蛋白G2化片段的融合蛋 白（美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,451，313)。此外，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,605,690設(shè)及對(duì)免疫球蛋白化片段中的氨 基酸殘基進(jìn)行修飾并公開(kāi)了使用通過(guò)修飾免疫球蛋白化片段中具體的補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)或受 體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基獲得的化片段通過(guò)基因重組方法制備的TNFR-IgGl化融合蛋白。 而且，使用如上所述修飾的免疫球蛋白Fc區(qū)通過(guò)基因重組方法制備融合蛋白的方法也在美 國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,277,375、6,410,008和6,444,792中公開(kāi)。但是，具有與其融合的免疫球蛋白化 片段的生物藥需要克服由Fc片段固有的效應(yīng)子功能引起的細(xì)胞毒性問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引技術(shù)問(wèn)題
[0006] 本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了大量的努力來(lái)制備具有免疫球蛋白化片段到生理活性的多 膚造成的增加的血清體內(nèi)半衰期的綴合物。結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生理活性的多膚W 單體形式連接至免疫球蛋白化片段時(shí)，與當(dāng)生理活性的多膚W多聚體形式存在時(shí)相比，甚 至在大鼠動(dòng)物模型中，它顯示了顯著降低的受體介導(dǎo)的清除率并且還顯示了長(zhǎng)的半衰期， 從而完成本發(fā)明。
[0007] 技術(shù)方案
[000引本發(fā)明的目標(biāo)是提供包含綴合物的長(zhǎng)效藥物組合物，所述綴合物包括連接至免疫 球蛋白化片段的生理活性的多膚，其中組合物包含單體綴合物一-其包括連接至單個(gè)免疫 球蛋白化片段的一分子的生理活性的多膚，并且任選地包含多聚體綴合物一-其包括連接 至單個(gè)免疫球蛋白化片段的兩分子或更多分子的相同的生理活性的多膚，條件是組合物中 單體綴合物與多聚體綴合物的摩爾比為至少19。
[0009] 本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供生理活性的多膚單體-免疫球蛋白Fc片段綴合物，其包 括經(jīng)由非膚基連接體連接至免疫球蛋白Fc片段的生理活性的多膚單體，其中生理活性的多 膚W單體形式經(jīng)由非膚基連接體連接至免疫球蛋白化片段，該綴合物與包括框內(nèi)連接至免 疫球蛋白Fc片段的生理活性的多膚的綴合物相比，顯示了降低的受體介導(dǎo)的內(nèi)化或受體介 導(dǎo)的清除率。
[0010] 本發(fā)明的仍另一目標(biāo)是提供制備長(zhǎng)效藥物組合物的方法，該方法包括：（a)將生理 活性的多膚連接至免疫球蛋白化片段W制備生理活性的多膚-免疫球蛋白化片段綴合物的 混合物;和(b)自該混合物分離生理活性的多膚單體-免疫球蛋白化片段綴合物，該生理活 性的多膚單體-免疫球蛋白化片段綴合物包括連接至單個(gè)免疫球蛋白Fc片段的一分子的生 理活性的多膚。
[0011] 有益效果
[0012] 如上所述，本發(fā)明的綴合物一-其包括連接至免疫球蛋白化綴合物的生理活性的 多膚單體一-顯示了顯著降低的受體介導(dǎo)的內(nèi)化或受體介導(dǎo)的清除率，并且因此具有增加 的血清半衰期。因此，本發(fā)明的綴合物可W提供具有增加的血清半衰期和治療優(yōu)越性的藥 物。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1示意性地顯示了生理活性的多膚單體-Fc綴合物的代表性結(jié)構(gòu)（圖1A)和生理 活性的多膚二聚體-Fc綴合物的最主要構(gòu)型（圖1B)。
[0014] 圖2顯示了化P-I激動(dòng)劑-免疫球蛋白化片段綴合物(本發(fā)明的實(shí)施例）和化P-I激 動(dòng)劑-免疫球蛋白Fc片段融合蛋白--其中化P-I激動(dòng)劑W二聚體形式存在（比較實(shí)施 例)一-之間的受體內(nèi)化程度的比較。
[001引圖3顯示了本發(fā)明的實(shí)施例的化P-I激動(dòng)劑綴合物和比較實(shí)施例的化P-I激動(dòng)劑綴 合物之間的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的比較。
[0016] 最佳模式
[0017] 為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，在一方面，本發(fā)明提供了包含綴合物的長(zhǎng)效藥物組合物，所述 綴合物包括連接至免疫球蛋白Fc片段的生理活性的多膚，其中組合物包含單體綴合物一一 其包括連接至單個(gè)免疫球蛋白Fc片段的一分子的生理活性的多膚，并且任選地包含多聚體 綴合物一一其包括連接至單個(gè)免疫球蛋白化片段的兩分子或更多分子的相同的生理活性 的多膚，條件是組合物中單體綴合物與多聚體綴合物的摩爾比為至少19。
[001引在一個(gè)實(shí)施方式中，長(zhǎng)效藥物組合物中包含的綴合物可包括插入生理活性的多膚 和免疫球蛋白Fc片段之間W將生理活性的多膚連接至免疫球蛋白Fc片段的非膚基連接體。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，與二聚體綴合物一一其包括經(jīng)由非膚基連接體連接至單個(gè) 免疫球蛋白化片段的兩分子的生理活性的多膚，或綴合物一一其包括框內(nèi)連接至免疫球蛋 白Fc片段的生理活性的多膚二聚體一一相比，單體綴合物可顯示降低的受體介導(dǎo)的內(nèi)化或 受體介導(dǎo)的清除率。
[0020] 在又另一個(gè)實(shí)施方式中，生理活性的多膚可選自膜高血糖素樣膚-l(GLP-l)、粒細(xì) 胞集落刺激因子(G-CSF)、人生長(zhǎng)激素化GH)、紅細(xì)胞生成素化P0)、膜高血糖素、胃泌酸調(diào)節(jié) 素、膜島素、生長(zhǎng)激素釋放激素、生長(zhǎng)激素釋放膚、干擾素、干擾素受體、G-蛋白-偶聯(lián)受體、 白介素、白介素受體、酶、白介素結(jié)合蛋白、細(xì)胞因子結(jié)合蛋白、巨隧細(xì)胞活化因子、巨隧細(xì) 胞膚、B細(xì)胞因子、T細(xì)胞因子、蛋白A、過(guò)敏抑制物、細(xì)胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋己毒素、月中 瘤壞死因子、腫瘤抑制素、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子、曰-1抗膜蛋白酶、白蛋白、a-乳白蛋白、載脂蛋白-E、高度糖基化的紅細(xì)胞生成素、血管生成素、血紅蛋白、凝血酶、凝血酶受體活化膚、血栓調(diào) 節(jié)蛋白、血液因子￥11、￥11曰、￥111、^和乂111、纖維蛋白溶酶原活化因子、纖維蛋白-結(jié)合膚、 尿激酶、鏈激酶、水賠素、蛋白C、C-反應(yīng)蛋白、腎素抑制物、膠原酶抑制物、超氧化物歧化酶、 瘦蛋白、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、上皮生長(zhǎng)因子、表