一種犬羊膜的制備及保存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及組織工程學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種犬羊膜的制備及保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊膜是胎盤(pán)的最內(nèi)層，光滑且具有一定的彈性，厚度約為0.02至0.5mm。羊膜可分 為五層:分別為單層柱狀上皮細(xì)胞層，致密的基底膜層，富含膠原的非細(xì)胞層，W及富含I、 III、IV、V和VII型膠原蛋白、層粘連蛋白的結(jié)締組織層。結(jié)締組織層分為=個(gè)部分:致密的 網(wǎng)狀纖維組成的無(wú)細(xì)胞層；網(wǎng)狀零星分布成纖維細(xì)胞且疏松的成纖維細(xì)胞層；W及海綿層。 其中包括絨毛膜W及復(fù)雜的纖維組成并被粘液包裹。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床觀(guān)察顯示，人羊 膜的基底膜可W促進(jìn)結(jié)膜干細(xì)胞分化為結(jié)膜上皮細(xì)胞，促進(jìn)結(jié)膜上皮細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞 轉(zhuǎn)化，促進(jìn)角膜緣干細(xì)胞增殖并提供其有利的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞移行，抑制結(jié)膜 下纖維組織增生，抑制新生血管形成，抗炎抗菌等功能。其基地膜可W阻止上皮細(xì)胞調(diào)亡、 促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和分化。新鮮的羊膜含有一些生長(zhǎng)因子，有利于上皮細(xì)胞的分化、移行 和增強(qiáng)上皮細(xì)胞的粘附性的作用。羊膜可W阻止白細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制多種蛋白酶如膜蛋白、纖 維蛋白酶、組織蛋白酶等，通過(guò)抑制相應(yīng)的酶減輕炎癥反應(yīng)、縮短炎癥持續(xù)時(shí)間及新生血管 生成。
[0003] 羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)為理想的組織學(xué)工程學(xué)材料，目前尚無(wú)使用犬羊膜進(jìn)行運(yùn)一材料 制備的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的是現(xiàn)有技術(shù)不能制備效果好的犬羊膜的技術(shù)問(wèn)題。
[0005] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種犬羊膜的制備方法，將無(wú)菌獲得的犬羊膜 置于無(wú)菌生理鹽水溶液中；
[0006] 使用大量的無(wú)菌0.9%氯化鋼的生理鹽水溶液進(jìn)行反復(fù)沖洗，將羊膜上多余的血 跡、粘液及絨毛膜組織碎片沖洗掉；
[0007] 使用滅菌的主要成分為化2HP04、KH2P04、化a和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS反復(fù) 沖洗，將可見(jiàn)的血管、血凝塊清洗掉，清洗后的羊膜應(yīng)呈顏色均一，柔軟的半透明膜狀。
[000引還包括W下步驟，將洗好的羊膜置于1%聚乙二醇辛基苯基酸TritonX-IOO溶液中 密閉，置于37°C恒溫?fù)u床中震蕩24h;
[0009] 用主要成分為化甜P04、KH2P04、化a和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS充分漂洗干凈， 加入0.25 %膜蛋白酶0.02 %乙二胺四乙酸邸TA，放入恒溫培養(yǎng)箱37°C消化4h;
[0010] 加入等量的各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基停止消化，使用主要成分為化2HP04、 K肥P04、NaCl和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS充分漂洗干凈；
[0011] 在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞殘留情況，觀(guān)察無(wú)細(xì)胞殘留即可分為約2平方厘米小塊 保存。
[001^ 還包括W下步驟，將各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基同純甘油1:1進(jìn)行混合，使用 20微米孔徑濾膜進(jìn)行過(guò)濾得到無(wú)菌的保存液約4毫升一份分裝至無(wú)菌的5ml離屯、管中，將所 述約2平方厘米小塊的犬羊膜分別放入有保存液的離屯、管中，使保存液完全浸潤(rùn)犬羊膜，密 封后放入-80°C冰箱保存。
[0013] 本發(fā)明還包括一種犬羊膜的保存方法，將各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基同純甘 油1:1進(jìn)行混合，使用20微米孔徑濾膜進(jìn)行過(guò)濾得到無(wú)菌的保存液約4毫升一份分裝至無(wú)菌 的5ml離屯、管中，將按照上述權(quán)利要求1或2制備的犬羊膜分別放入有保存液的離屯、管中，使 保存液完全浸潤(rùn)犬羊膜，密封后放入-80°C冰箱保存。
[0014] 通過(guò)W上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供一種犬羊膜的制備及保存方法，本發(fā)明的優(yōu) 點(diǎn)在于制得的犬羊膜生物相容性好，是理想組織工程學(xué)材料。保存的犬羊膜有效可用時(shí)間 長(zhǎng)，避免了使用時(shí)沒(méi)有有效可用材料的尷尬。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
[0016] 需要說(shuō)明的是，如果不沖突，本發(fā)明實(shí)施例W及實(shí)施例中的各個(gè)特征可W相互結(jié) 合，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0017] 實(shí)施例一，一種犬羊膜的制備方法，將無(wú)菌獲得的犬羊膜置于無(wú)菌生理鹽水溶液 中；
[0018] 使用大量的無(wú)菌0.9%氯化鋼的生理鹽水溶液進(jìn)行反復(fù)沖洗，將羊膜上多余的血 跡、粘液及絨毛膜組織碎片沖洗掉；
[0019] 使用滅菌的主要成分為化2HP04、K肥P04、NaQ和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS反復(fù)沖 洗，將可見(jiàn)的血管、血凝塊清洗掉，清洗后的羊膜應(yīng)呈顏色均一，柔軟的半透明膜狀。
[0020] 還包括W下步驟，將洗好的.羊膜置于1%聚乙二醇辛基苯基酸化itonX-100溶液 中密閉，置于37°C恒溫?fù)u床中震蕩24h;
[0021] 用主要成分為Na2HP04、K肥P04、化Cl和KCl的憐酸鹽緩沖PBS溶液憐酸鹽緩沖溶液 PBS充分漂洗干凈，加入0.25 %膜蛋白酶0.02 %乙二胺四乙酸邸TA，放入恒溫培養(yǎng)箱37°C消 化4h;
[0022] 加入等量的各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基停止消化，使用主要成分為化2HP04、 K肥P04、NaCl和KCl的憐酸鹽緩沖溶液PBS充分漂洗干凈；
[0023] 在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞殘留情況，觀(guān)察無(wú)細(xì)胞殘留即可分為約2平方厘米小塊 保存。
[0024] 還包括W下步驟，將各種氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基同純甘油1:1進(jìn)行混合，使用 20微米孔徑濾膜進(jìn)行過(guò)濾得到無(wú)菌的保存液約4毫升一份分裝至無(wú)菌的5ml離屯、管中，將所 述約2平方厘米小塊的犬羊膜分別放入有保存液的離屯、管中，使保存液完全浸潤(rùn)犬羊膜，密 封后放入-80°C冰箱保存。
[0025] 犬羊膜的制備及保存的材料及儀器
[00%] 材料：無(wú)菌犬羊膜、微米濾膜、試劑、Du化ecco's Modified Eagle Medium basic (DMEM basiC)培養(yǎng)液、無(wú)菌培養(yǎng)皿、0.25 % 膜酶-EDTA、IYi tonX-100、化〇3地ate Buf f ered Saline (PBS)、純甘油、0.25 %戊二醒溶液其中，縮寫(xiě)的含義為：Phosphate Buffered Saline(PBS):憐酸鹽緩沖溶液、TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基酸、EDTA:乙二胺四乙酸、 DMEM:各種氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基。
[0027]各種氨基酸和葡萄糖培養(yǎng)基DMEM成分：
[00巧]儀器:倒置顯微鏡、超凈工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、C02培養(yǎng)箱、-80°C冰箱。
[0030]羊膜是包裹胎兒的一層半透明的膜狀物，獲得時(shí)可W將透明度好的組織盡量保 留，但其于胎盤(pán)連接處則不必過(guò)多的保留，獲得的羊膜應(yīng)盡可能的透明部分，運(yùn)樣在清洗的 過(guò)程中也會(huì)比較容易并獲得血管組織較少的羊膜。取材時(shí)選取血管少的組織可W大大降低 純性分離時(shí)的難度，并同時(shí)減少對(duì)羊膜本身的破壞。分離時(shí)也應(yīng)小屯、，盡量分離干凈，得到 單層的羊膜組織，運(yùn)對(duì)之后制備過(guò)程中運(yùn)種試劑的充分接觸也有很大的幫助。否則有可能 出現(xiàn)脫細(xì)胞不完整及過(guò)度處理造成的羊膜損傷。
[0031] 本發(fā)明選取了對(duì)基底膜傷害較少，但去細(xì)胞效果略差的非離子型去污劑化itonx-100并結(jié)合使用膜蛋白酶消化來(lái)達(dá)到比較完全的脫細(xì)胞作用。同時(shí)對(duì)機(jī)械性能及細(xì)胞微結(jié) 構(gòu)破壞最少。
[0032] 掃描電鏡的結(jié)果也支持了運(yùn)一方案的可行性，掃描電鏡下可見(jiàn)表面有一層基底 膜，在其下會(huì)出現(xiàn)交織成網(wǎng)狀的膠原纖維，說(shuō)明制作過(guò)程良好的保存了羊膜原有的物理性 狀。對(duì)于只含有一層上皮細(xì)胞及基質(zhì)中少量成纖維母細(xì)胞的犬羊膜來(lái)說(shuō)，使用化itonX-100 處理后，再結(jié)合膜蛋白酶處理會(huì)達(dá)到比較理想的去細(xì)胞效果，而對(duì)其自身的基底膜、各種生 物因子及生物相容性影響降至到最小，掃描電鏡的結(jié)果也很好的說(shuō)明了運(yùn)一點(diǎn)。
[0033] 實(shí)施例二，一種犬羊膜的保存方法，本發(fā)明還包括一種犬羊膜的保存方法，將各種 氨基酸和葡萄糖DMEM培養(yǎng)基同純甘油1:1進(jìn)行混合，使用20微米孔徑濾膜進(jìn)行過(guò)濾得到無(wú) 菌的保存液約4毫升一份分裝至無(wú)菌的5ml離屯、管中，將按照上述權(quán)利要求1或2制備的犬羊 膜分別放入有保存液的離屯、管中，使保存液完全浸潤(rùn)犬羊膜，密封后放入-80°C冰箱保存。
[0034] 保存后犬羊膜的質(zhì)量檢驗(yàn)
[0035] 分別將剛制得的