多聚化技術(shù)的制作方法
【專利說明】多聚化技術(shù)
[000。相關(guān)申請案交叉引用
[0002]本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時(shí)專利申請序號61/791，600的35 U.S.C.§119(e)的權(quán)益，所述申請W全文引用的方式并入本文。
[000；3] 序列表
[0004] 本說明書參考2014年3月14日W名稱為"2003080-0636_ST25"的ascii.txt文件的 電子形式提交的序列表。.txt文件產(chǎn)生于2014年3月7日且大小為100化。
【背景技術(shù)】
[0005] 當(dāng)前正開發(fā)用于多種治療、診斷和研究應(yīng)用的雙特異性和多特異性結(jié)合劑。許多 此類藥劑由將祀向不同抗原的抗體組分彼此締合，例如W融合蛋白形式或通過抗體組分的 交聯(lián)產(chǎn)生。此類方法尤其包括通過各自表達(dá)單特異性抗體的細(xì)胞的融合(例如融合瘤）、兩 個(gè)或兩個(gè)W上單特異性抗體的化學(xué)共輛和/或重組DNA技術(shù)產(chǎn)生多特異性抗體。但是，此類 方法不受限制。
[0006] 確切地說，重組DNA技術(shù)已產(chǎn)生若干多特異性和多功能性的工程改造抗體。隨著單 鏈Fv分子的出現(xiàn)，已取得工程改造抗體中的許多進(jìn)步。此類工程改造抗體已展現(xiàn)相比于傳 統(tǒng)抗體改進(jìn)的特性，其至少部分歸因于已產(chǎn)生的獨(dú)特形式。盡管存在若干用于工程改造多 特異性抗體藥劑的策略，大部分努力聚焦于僅改進(jìn)某些功能方面。因此，由抗體組分制得的 大部分工程改造蛋白質(zhì)不具有將帶來大部分藥理學(xué)意義的所有所需功能特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明尤其提供包括多聚化組分的改進(jìn)的多特異性結(jié)合劑。此類提供的藥劑具有 相比于不具有此類多聚化組分的親本結(jié)合劑改進(jìn)的功能特性。
[000引在某些實(shí)施例中，提供的藥劑由個(gè)別多膚組成，其中的每一者包括至少一個(gè)，且更 通常至少兩個(gè)或兩個(gè)W上特異性地與特定標(biāo)祀相互作用的結(jié)合部分。在多個(gè)實(shí)施例中，此 類結(jié)合部分為抗體組分或包含抗體組分。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明尤其提供包含具有包含 至少抗體5F11的結(jié)合元件的氨基酸序列的抗體組分的多膚。根據(jù)本發(fā)明，提供的藥劑內(nèi)的 此類個(gè)別多膚經(jīng)工程改造驗(yàn)W包括多聚化組分。在多個(gè)實(shí)施例中，此類多膚包括二聚化組 分。在多個(gè)實(shí)施例中，二聚化組分為人類肝細(xì)胞核因子-化的元件。
[0009] 在本文所述的某些特定實(shí)施例中，提供的藥劑包含經(jīng)工程改造 W含有多聚化組分 的雙特異性抗體多膚。
[0010] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供包含兩個(gè)融合蛋白的雙特異性結(jié)合劑，其中的每一 者包含結(jié)合第一抗原的第一抗體組分;結(jié)合第二抗原的第二抗體組分，和包含人類肝細(xì)胞 核因子-Ια化NF-la)元件的二聚化組分。
[0011] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的第一和第二抗原是不相同的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明 的第一抗原為腫瘤抗原。在一些實(shí)施例中，腫瘤抗原與B細(xì)胞或T細(xì)胞相關(guān)。在一些實(shí)施例 中，本發(fā)明的腫瘤抗原為GD2。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的腫瘤抗原為GD3。
[0012] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的第二抗原存在于Τ細(xì)胞上。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的 第二抗原為CD3。
[0013] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的二聚化組分具有與人類HNF-la(SEQ ID Ν0:1)的氨基 酸殘基 1-32 具有至少約 50%(例如至少約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 % ) -致性的序列。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的二聚化域具有與 人類HNF-la(SEQ ID NO: 1)的氨基酸殘基1-32實(shí)質(zhì)上一致的序列。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明 的二聚化域包含人類HNF-la(SEQ ID NO: 1)的氨基酸殘基1-32。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的 二聚化域?yàn)槿祟怘NF-la(SEQ ID N0:1)的氨基酸殘基1-32。
[0014] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的雙特異性粘合劑具有與SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:11、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:13、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:15、SEQ IDN0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQ 10^:22或沈9 10^:23具有至少約50%(例如至少約55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% ) -致性的序列。
[0015] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的雙特異性粘合劑具有與SEQ ID:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、沈Q ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、沈Q ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:11、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:13、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:15、沈Q ID N0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQID NO:22或沈Q ID NO:23實(shí)質(zhì)上一致的序列。
[0016] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的雙特異性粘合劑具有與SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:11、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:13、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:15、SEQ IDN0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQ ID NO :22或沈Q ID NO :23-致的序列。
[0017] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的雙特異性粘合劑包含選自SEQ ID N0:2、沈Q ID N0:3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:11、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:13、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:15、SEQ IDN0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQ ID NO :22或沈Q ID NO :23的序列。
[0018] 在一些實(shí)施例中，提供包含本發(fā)明的雙特異性粘合劑和藥學(xué)上可接受的載劑的藥 物組合物。
[0019] 在一些實(shí)施例中，提供融合蛋白，其從5'到3'包含第一抗體組分、第二抗體組分和 包含人類肝細(xì)胞核因子-Ια化NF-la)元件的二聚化組分。在一些實(shí)施例中，人類HNF-化元件 包含人類HNF-化的氨基酸殘基1-32。
[0020] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白的第一和第二抗體組分為單鏈可變區(qū)片段 (scFvs)。
[0021] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白的第一scFv結(jié)合到腫瘤抗原。在一些實(shí)施例 中，本發(fā)明的融合蛋白的第一scFv結(jié)合到為GD2的腫瘤抗原。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的融 合蛋白的第一scFv結(jié)合到為GD3的腫瘤抗原。
[0022] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白的第二scFv結(jié)合到存在于Τ細(xì)胞上的抗原。在 一些實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白的第二scFv結(jié)合到為CD3的存在于Τ細(xì)胞上的抗原。
[0023] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白具有與SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、沈Q ID NO: 10、沈Q ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQID N0:22或SEQ ID N0:23具有至少約50%(例如至少約55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% ) -致性的序列。
[0024] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白具有與沈Q ID: 2、沈Q ID NO: 3、沈Q ID NO: 4、沈Q ID N0:5、沈Q ID N0:6、沈Q ID N0:7、沈Q ID N0:8、沈Q ID N0:9、沈Q ID N0:10、 SEQIDN0:11、WQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0: 16、沈Q ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、沈Q ID N0:21、SEQ ID NO:22或沈Q ID NO:23實(shí)質(zhì)上一致的序列。
[00巧]在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白具有與沈Q ID: 2、沈Q ID NO: 3、沈Q ID NO: 4、沈Q ID N0:5、沈Q ID N0:6、沈Q ID N0:7、沈Q ID N0:8、沈Q ID N0:9、沈Q ID N0:10、 SEQIDN0:11、WQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0: 16、沈Q ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、沈Q ID N0:21、SEQ ID NO :22或沈Q ID NO :23-致的序列。
[00%] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的融合蛋白包含選自SEQ ID:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、沈Q ID NO: 10、沈Q ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、WQIDN0:17、WQIDN0:18、WQIDN0:19、WQIDN0:20、WQIDN0:21、WQID NO :22或沈Q ID NO :23的序列。
[0027] 在一些實(shí)施例中，提供包含兩個(gè)本發(fā)明的融合蛋白的二聚雙特異性粘合劑。
[0028] 在一些實(shí)施例中，提供包含含兩個(gè)本發(fā)明的融合蛋白的二聚雙特異性粘合劑和藥 學(xué)上可接受的載劑的藥物組合物。
[0029] 在一些實(shí)施例中，提供編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸序列。
[0030] 在一些實(shí)施例中，提供包含本發(fā)明的核酸序列的載體。
[0031] 在一些實(shí)施例中，提供包含本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的 宿主細(xì)胞選自由W下組成的群組:細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，本發(fā) 明的宿主細(xì)胞選自由W下組成的群組:大腸桿菌、甲醇酵母、S巧、COS、HEK293和C冊細(xì)胞。
[0032] 在一些實(shí)施例中，提供產(chǎn)生本發(fā)明的二聚雙特異性結(jié)合劑的方法，所述方法包含 在適合于表現(xiàn)二聚雙特異性粘合劑的條件下培養(yǎng)含有包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸 序列的載體的宿主細(xì)胞，和回收二聚雙特異性結(jié)合劑。
[0033] 在一些實(shí)施例中，在提供包含包括第一和第二抗體組分的雙特異性抗體藥劑的高 親和力雙特異性抗體組合物的方法中，提供一改進(jìn)，所述改進(jìn)包含將此類第一和第二抗體 組分中的至少一個(gè)提供為與由人類HNF-化二聚化元件組成的二聚化組分的融合物，W使得 抗體組分-二聚化組分融合物能夠形成同型二聚體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的二聚化組分 包含人類HNF-化的氨基酸殘基1-32。
[0034] 在一些實(shí)施例中，提供殺死腫瘤細(xì)胞的方法，所述方法包含W下步驟:使腫瘤細(xì)胞 與雙特異性結(jié)合劑接觸，所述結(jié)合劑包含兩個(gè)從5 '到3 '各自包含結(jié)合到腫瘤抗原的第一抗 體組分、結(jié)合到T細(xì)胞上的CD3的第二抗體組分和包含人類HNF-化元件的二聚化組分的融合 蛋白，使得雙特異性結(jié)合劑能夠二聚化W形成同型二聚體，接觸在同型二聚體所結(jié)合的T細(xì) 胞足W介導(dǎo)殺死腫瘤細(xì)胞的條件和時(shí)間下進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的二聚化組分包 含人類HNF-la的氨基酸殘基1-32。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的雙特異性結(jié)合劑的第一和第 二抗體組分為單鏈可變區(qū)片段(scFvs)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的腫瘤抗原為GD2。在一些 實(shí)施例中，本發(fā)明的腫瘤抗原為GD3。
[0035] 在一些實(shí)施例中，提供抑制腫瘤生長的方法，所述方法包含W下步驟:使腫瘤與雙 特異性結(jié)合劑接觸，所述結(jié)合劑包含兩個(gè)從5 '到3 '各自包含結(jié)合到腫瘤抗原的第一抗體組 分、結(jié)合到T細(xì)胞上的CD3的第二抗體組分和包含人類HNF-la元件的二聚化組分的融合蛋 白，使得雙特異性結(jié)合劑能夠二聚化W形成同型二聚體，接觸在同型二聚體所結(jié)合的T細(xì)胞 足W抑制腫瘤生長的條件和時(shí)間下進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的二聚化域包含人類 HNF-la的氨基酸殘基1-32。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的雙特異性結(jié)合劑的第一和第二抗體 組分為單鏈可變區(qū)片段(scFvs)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的腫瘤抗原為GD2。在一些實(shí)施例 中，本發(fā)明的腫瘤抗原為GD3。
[0036] 在一些實(shí)施例中，提供雙特異性結(jié)合劑，所述結(jié)合劑包含兩個(gè)從5 '到3 '各自包含 結(jié)合到腫瘤抗原的第一抗體組分、結(jié)合到T細(xì)胞上的CD3的第二抗體組分和包含人類HNF-la 元件的二聚化組分的融合蛋白，使得雙特異性結(jié)合劑能夠二聚化W形成同型二聚體;其中 同型二聚體的特征在于相比于不包含二聚化組分的其它方面類似的雙特異性結(jié)合劑，半衰 期較長。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的二聚化組分包含人類HNF-la的氨基酸殘基1-32。在一些 實(shí)施例中，本發(fā)明的雙特異性結(jié)合劑的第一和第二抗體組分為單鏈可變區(qū)片段(scFvs)。在 一些實(shí)施例中，本發(fā)明的腫瘤抗原為GD2。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的腫瘤抗原為GD3。
【附圖說明】
[0037] 包含W下諸圖的本文中包括的圖式僅出于說明的目的而非限制性的。
[003引圖1不按比例地顯示scFv日F1廣scFv日kt3(GD2XCD3)和二聚scFv日F1廣scFv日KT3-HDD雙 特異性結(jié)合劑的示意圖。
[0039] 圖2A顯示GD2XCD3和GD2XCD3-皿D雙特異性結(jié)合劑的GD2結(jié)合(上圖）和杰卡特細(xì) 胞上的CD3結(jié)合(下圖）的化ISA結(jié)合曲線。
[0040] 圖2B顯示GD2 X CD3和GD2 X CD3-HDD雙特異性結(jié)合劑的杰卡特細(xì)胞上的CD3結(jié)合。
[0041 ] 圖3A和3B顯示GD2 X CD3和GD2 X CD3-皿D雙特異性結(jié)合劑的GD2結(jié)合的Biacore傳 感圖。顯示W(wǎng)下雙特異性抗體濃度處的痕量:62.5、125、250、500、1000、2000nM。
[0042] 圖4顯示GD2 X CD3和GD2 X CD3-皿D雙特異性結(jié)合劑的黑素瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 系的T細(xì)胞介導(dǎo)的體外殺死的百分比。
[0043] 圖5顯示植入到異種移植研究模型的對照(無處理）、GD2 X CD3和GD2 XCD3-HDD處 理組中的BALB/cA-Rag2K(V比-2R 丫 K0(DK0)小鼠中的皮下SKNLD腫瘤的腫瘤體積(mm3)。
[0044] 圖6顯示植入到異種移植研究模型的對照(無處理KGD2XCD3和GD2XCD3-HDD處 理組中的BALB/cA-Rag2K(V比-2R 丫 KO(DKO)小鼠中的皮下M14腫瘤的腫瘤體積(mm3)。
[0045] 圖7顯示3LHBT和3LHBT-HDD雙特異性結(jié)合劑的GD2結(jié)合的ELISA結(jié)合曲線。
[0046] 圖8顯示具有不同二聚化域的GD2XCD3雙特異性結(jié)合劑的GD2結(jié)合的化ISA結(jié)合曲 線。
[0047] 圖9顯示具有不同二聚化域的GD2XCD3雙特異性結(jié)合劑的黑素瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤 細(xì)胞系的T細(xì)胞介導(dǎo)的體外殺死的百分比。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 本發(fā)明不限于描述的特定方法和實(shí)驗(yàn)條件，因此方法和條件可W變化。還應(yīng)了解， 本文中所使用的術(shù)語僅僅是為了描述特定實(shí)施例，而并不意圖為限制性的，除非指示如此， 運(yùn)是由于本發(fā)明的范圍將僅僅受到所附權(quán)利要求書的限制。
[0049] 除非另有說明，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語和短語均具有與所屬領(lǐng)域 的技術(shù)人員通常所理解相同的含義。盡管在本發(fā)明的操作或測試中也可W使用與本文中描 述的方法和材料類似或等效的任何方法和材料，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。本文中 所提及的所有公開案都W引用的方式并入。
[00加]定義
[0051] 為了使本發(fā)明更易于理解，在下文中首先對某些術(shù)語進(jìn)行定義。W下術(shù)語和其它 術(shù)語的其它定義闡述在整個(gè)說明書中。
[0052] 除非上下文另外明確規(guī)定，否則如在本說明書和所附權(quán)利要求書中所使用的單數(shù) 形式"一個(gè)/種(a/an)"和"所述"包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。因此，舉例來說，提及的"一種方法"包 括一或多種本文所述類型和/或所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明之后將變得顯而易見等 方法和/或步驟。
[0053] 如本文所用，"親和力成熟"（或"親和力成熟抗體"）是指在抗體的一或多個(gè)CDR中 具有一或多個(gè)改變的抗體，所述改變導(dǎo)致相比于不具有那些改變的親本抗體的抗體對于抗 原的親和力的改進(jìn)。在一些實(shí)施例中，親和力成熟抗體對標(biāo)祀抗原將具有納摩爾或甚至皮 摩爾的親和力。親和力成熟抗體可通過所屬領(lǐng)域中已知的多種程序中的任一種產(chǎn)生。馬克 斯(Marks)等人生物技術(shù)(BioTechnology) 10:779-783( 1992)描述通過Vh和化域改組產(chǎn)生的 親和力成熟。CDR和/或構(gòu)架殘基的隨機(jī)突變誘發(fā)由W下各者描述：己己斯(Barbas)等人美 國國家科學(xué)院院刊(Proc 化t.Acad. Sci，USA)91:3809-3813( 1994);希爾（Schier)等人基 因（Gene) 169:147-155( 1995);耶爾頓(Yelton)等人免疫學(xué)雜志（J. Immunol. )155:1994-2004( 1995);杰克遜（Jackson)等人，免疫學(xué)雜志154( 7) :3310-9(1995): W及霍金斯 化awkins)等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol. )226:889-896( 1992)。
[0054] 如本文所用，"抗體"具有其技術(shù)理解如本文所用，"抗體"具有其技術(shù)理解含義且 是指特異性結(jié)合于特定抗原的免疫球蛋白（Ig)。如所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所已知，在自 然界中產(chǎn)生的抗體通常包含四個(gè)多膚鏈，兩個(gè)重化)鏈和兩個(gè)輕化)鏈。每一重鏈和輕鏈包 含可變區(qū)（在本文中分別縮寫為肥VR或Vh和LCVR或Vl)和恒定區(qū)。重鏈的恒定區(qū)包含扣1、姑2 和姑3域(和任選地Ch4域，在IgM和I姐的情況下）。輕鏈的恒定區(qū)包含一個(gè)域(CL)。Vh和化區(qū) 可W進(jìn)一步含有高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)，穿插有稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守區(qū)。每一 Vh和Vl包含Ξ個(gè)CDR和四個(gè)FR，從氨基末端到簇基末端按W下次序配置:FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可W是任何類型（例如IgM、I曲、IgG、IgA和I巧）、類別 (例如 I gGi、I g