一種含有溶菌酶的牙膏的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及口腔衛(wèi)生領(lǐng)域，具體設(shè)及一種牙膏。
【背景技術(shù)】
[0002] 醫(yī)學(xué)上將圍繞并覆蓋在牙齒周圍的軟組織稱為牙銀，發(fā)生于牙銀組織的急慢性炎 癥稱為牙銀炎。表現(xiàn)為牙銀出血，紅腫，脹痛，繼續(xù)發(fā)展侵犯硬組織，產(chǎn)生牙周炎，包括牙銀 組織的炎癥及全身疾病在牙銀的表現(xiàn)。牙菌斑是基質(zhì)包裹的互相粘附、或粘附于牙面、牙間 或修復(fù)體表面的軟而未礦化的細(xì)菌性群體，為不能被水沖去或漱掉的一種細(xì)菌性生物膜。 當(dāng)牙菌斑量較少時(shí)，肉眼是很難觀察到的，通常用菌斑指示劑可W很好地顯示。
[0003] 牙膏是輔助刷牙的一種制劑，可增強(qiáng)刷牙的摩擦力，幫助去除食物殘屑、軟垢和牙 菌斑，有助于消除或減輕口腔異味。通過(guò)機(jī)械性方法，徹底去除牙菌斑或者防治牙銀炎對(duì)大 多數(shù)人來(lái)說(shuō)很難做到。因此，研究者提出在牙膏中加入一定的抗菌劑。目前，市面上用于防 治牙銀炎和牙菌斑的功能性牙膏中的抗菌劑主要為西藥，長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生耐藥性。生物 酶牙膏是一種含有生物酶活性成分W及酶穩(wěn)定劑、激活劑等成分的牙膏，它能更進(jìn)一步地 殺菌抑菌，促進(jìn)口腔進(jìn)一步清潔，從而保護(hù)牙齒，增強(qiáng)口腔自身的防御體系。
[0004] 溶菌酶（lysozyme)又稱胞壁質(zhì)酶(muramidase)或N-乙酷胞壁質(zhì)聚糖水解酶(N-acetyImuramide glycanohy化Iase)，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過(guò)破 壞細(xì)胞壁中的N-乙酷胞壁酸和N-乙酷氨基葡糖之間的0-1，4糖巧鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多 糖分解成可溶性糖膚，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷 的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、 消炎、抗病毒等作用。溶菌酶(也稱溶解酶)是一個(gè)分子量為14.4kDa的酶，它能夠通過(guò)催化 膚聚糖中N-乙酷胞壁酸和N-乙酷氨基葡萄糖殘基間和殼糊精中N-乙酷葡糖胺殘基間的1， 4-0鏈的水解，而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁。在人體中，溶菌酶在細(xì)胞分泌液，如唾液、眼淚W及其 他一些體液中廣泛存在;也存在于線粒體中的細(xì)胞質(zhì)顆粒體中。此外，蛋清中也有大量的溶 菌酶。溶菌酶因能夠?qū)Ｒ坏淖饔糜谀康奈⑸锏募?xì)胞壁的鹽基水解蛋白酶，被廣泛的運(yùn)用 于食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)。
[000引溶菌酶（lysozyme)由18種129個(gè)氨基酸構(gòu)成的單純堿性球蛋白，分子量為 14.4邸a?；瘜W(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定。當(dāng)pH值為1.2~11.3范圍內(nèi)劇烈變化時(shí)，其結(jié)構(gòu)幾乎不變。在 酸性環(huán)境中，溶菌酶對(duì)熱的穩(wěn)定性很強(qiáng)；當(dāng)pH值為4~7時(shí)100°C處理Imin仍能保持原酶活 性；當(dāng)pH值為3時(shí)能耐100°C加熱處理45min;在干燥條件下，溶菌酶可W長(zhǎng)期在室溫存放，其 純品為白色或微黃色。黃色的結(jié)晶體或無(wú)定形粉末，無(wú)臭，味甜。易溶于水，遭堿易破壞，不 溶于丙酬和乙酸。作為醫(yī)藥用品，溶菌酶具有生物相容性好、對(duì)組織無(wú)刺激、無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]溶菌酶廣泛存在于家禽、鳥(niǎo)類的蛋清和哺乳動(dòng)物的淚液、唾液、血漿、尿、乳汁、白 細(xì)胞及其他體液和組織(如肝、腎）細(xì)胞內(nèi)；從大麥、無(wú)花果、木瓜和卷屯、菜、蘿h等植物中也 能分離出溶菌酶，其中W蛋清中含量為最高(約含0.3%)。而人乳、眼淚、唾液中的溶菌酶活 性遠(yuǎn)高于蛋清中（約為3倍)或其他來(lái)源的溶菌酶的活性。雞蛋清中的溶菌酶是動(dòng)物溶菌酶 的典型代表，是溶菌酶群中重要的研究對(duì)象，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。在哺乳動(dòng) 物的乳汁中，人乳汁中的溶菌酶含量是牛乳的3000倍。按來(lái)源不同，可將溶菌酶分為蛋清溶 菌酶、動(dòng)物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物產(chǎn)生的溶菌酶和細(xì)菌隧菌體產(chǎn)生的溶菌酶;按作用 細(xì)胞壁不同，可將溶菌酶分為細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶和真菌細(xì)胞壁溶菌酶。
[0007] 溶菌酶能夠?qū)Ｒ涣呀饽康募?xì)菌的細(xì)胞壁。它主要進(jìn)攻膚聚糖，水解連接N-乙酷胞 壁酸和N-乙酷葡糖胺第四位碳原子的0-1，4糖巧鍵。整個(gè)過(guò)程是，首先溶菌酶通過(guò)其兩個(gè)結(jié) 構(gòu)域之間的"溝"結(jié)合到膚聚糖分子上；隨后其底物在酶中形成過(guò)渡態(tài)的構(gòu)象。根據(jù) Phillips機(jī)制，溶菌酶與葡聚六糖結(jié)合。然后溶菌酶將葡聚六糖上的第四個(gè)糖扭曲為半椅 形構(gòu)象。在運(yùn)種扭曲狀態(tài)(能量較高）中，糖巧鍵很容易就發(fā)生斷裂。位于溶菌酶蛋白序列35 位的谷氨酸(Glu35)和52位的天冬氨酸(Asp52)的側(cè)鏈對(duì)溶菌酶的活性非常關(guān)鍵。Glu35作 為糖巧鍵的質(zhì)子供體，剪切底物的C-O鍵;而Asp52作為親核試劑參與生成糖基酶中間體。隨 后，糖基酶中間體與水分子發(fā)生反應(yīng)，水解生成產(chǎn)物，而酶保持不變。
[0008] 溶菌酶的提取方法包括W下幾種：1、直接結(jié)晶法:此法操作簡(jiǎn)單，成本低，但不能 用W分離微量的溶菌酶。2、離子交換層析法:此法具有簡(jiǎn)便、高效、成本低，且可自動(dòng)化連續(xù) 操作的優(yōu)點(diǎn)圈。3、親和層析:親和層析法分離純化的倍數(shù)較高、質(zhì)量較好，且可廣泛應(yīng)用于 各種來(lái)源的溶菌酶，用于濃縮和精制微量的溶菌酶。但是由于親和吸附劑的制作較復(fù)雜，限 制了其在工業(yè)上的大規(guī)模利用。4、超濾與親和層析結(jié)合:超濾與親和層析結(jié)合提取溶菌酶， 是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的新方法。首先用超濾除去大部分雜蛋白，保留溶菌酶，此時(shí)溶菌酶還較粗， 再用親和層析法得到精制產(chǎn)品。5、膜色譜技術(shù):20世紀(jì)80年代末，出現(xiàn)了親和膜色譜技術(shù)。 該技術(shù)兼具膜分離與親和分離的特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的膜分離、親和色譜相比，膜色譜技術(shù)不僅具 有純化倍數(shù)高、壓降小、分離時(shí)間短、生物大分子在分離過(guò)程中變性概率小，W及允許較快 的加料速度等特點(diǎn)，而且比柱親和色譜更易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。6、超濾:與傳統(tǒng)的生化分離技 術(shù)相比，超濾技術(shù)主要的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品的高產(chǎn)出量。然而盡管超濾技術(shù)在反滲析及濃縮等過(guò) 程中得到廣泛的應(yīng)用，但是作為在生物工業(yè)領(lǐng)域中潛能很大的一種蛋白質(zhì)分離技術(shù)，超濾 仍未被充分利用。7、反膠團(tuán)提取:反膠團(tuán)萃取是近年發(fā)展起來(lái)的一種新的萃取方法，它是利 用有機(jī)溶劑中加入少量表面活性劑形成的反膠團(tuán)來(lái)提取的方法，為一些不能使用有機(jī)溶劑 萃取的酶和活性蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)開(kāi)拓了一種新的分離技術(shù)，擴(kuò)大了有機(jī)溶劑萃取的 適用范圍。8、生物分離技術(shù)：W親和力為基礎(chǔ)的生物分離技術(shù)（固定金屬親和層析、親和沉 淀、親和過(guò)濾法），也是溶菌酶提取方法之一。
[0009] 溶菌酶具有多種獨(dú)特而重要的藥理作用。
[0010] 第一，抗菌消炎。細(xì)菌的細(xì)胞壁由胞壁質(zhì)組成，胞壁質(zhì)是由N-乙酷氨基葡萄糖及N-乙酷胞壁酸交替組成的多聚物，胞壁殘基上可W連接多膚，稱為膚聚糖。多糖W直鏈形式存 在，彼此鄰近的多糖鏈之間可W通過(guò)膚鏈部分相互連接，從而形成=維結(jié)構(gòu)。溶菌酶專一性 地作用于膚聚糖分子的N-乙酷胞壁酸與N-乙酷葡萄糖氨之間的糖巧鍵，結(jié)果使細(xì)菌細(xì)胞壁 變得松馳，失去對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，最后細(xì)胞溶解死亡;溶菌酶能直接殺滅革蘭陽(yáng)性菌，在 分泌型免疫球蛋白補(bǔ)體的參與下，還能殺滅革蘭陰性菌:如大腸埃希氏菌。溶菌酶還可與各 種誘發(fā)炎癥的酸性物質(zhì)結(jié)合，減少細(xì)菌內(nèi)毒素釋放，從而減輕內(nèi)毒素血癥發(fā)生，減緩炎癥發(fā) 生過(guò)程，并對(duì)抗生素有一定增效作用，改善組織基質(zhì)的黏多糖代謝，起到抗菌消炎、修復(fù)組 織的作用。經(jīng)試驗(yàn)證明，用1種纖維素共聚物將人溶菌酶和蛋白水解酶偶聯(lián)，可顯著提高溶 菌酶抗菌能力，加速傷口愈合。
[0011] 第二，抗病毒。溶菌酶在中性體液環(huán)境下帶有大量正電荷，可與帶有負(fù)電荷的病毒 蛋白直接作用，與DNA、RNA、脫附基蛋白相結(jié)合形成復(fù)鹽，使病毒失活。在被瘤疹病毒感染的 化Ia細(xì)胞培養(yǎng)液中加溶菌酶后有抑制細(xì)胞變性作用。溶菌酶也可抑制腺病毒生長(zhǎng)，可用于 帶狀瘤疹、腮腺炎、雞水痘、肝炎及流感等病毒性疾患治療。
[0012] 第=，增強(qiáng)免疫力。溶菌酶參與機(jī)體內(nèi)多種免疫反應(yīng)，在機(jī)體正常防御和非特異性 免疫中具有重要作用。它可改善和增強(qiáng)巨隧細(xì)胞吞隧消化功能，降低細(xì)胞抑制劑導(dǎo)致的白 細(xì)胞減少，結(jié)合細(xì)菌脂多糖，減輕內(nèi)毒素作用，W達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體抵抗力的目的。溶菌酶本