肝臟誘癌劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種肝臟誘癌劑、肝臟誘癌劑的制備方法以及基于肝臟誘癌劑建立原發(fā)性肝癌模型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率和死亡率均為世界首位，是嚴(yán)重危害健康的重大疾病(The management of hepatocellular carcinoma inA s i a:A guideline combining quantitative and qualitativeevaluat1n.B1sciTrends，2010,6:283-287)。遺憾的是其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找防治肝癌的有效手段，可更好地服務(wù)于人類健康(Adecade’s studies on metastasis of hepatocellular carcinoma.J Cancer Res ClinOncol,2004,130:187-196)o
[0003]要研究肝癌的發(fā)生機(jī)制，首先要建立與人類肝癌自然發(fā)生過程相似的動(dòng)物模型。常見的肝癌動(dòng)物模型有:自發(fā)性肝癌模型、移植型肝癌模型、轉(zhuǎn)基因肝癌模型以及化學(xué)誘發(fā)性肝癌模型。自發(fā)性肝癌由于發(fā)生情況不均，很難在短時(shí)間內(nèi)獲得大量類似的腫瘤學(xué)材料，且觀察時(shí)間長，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)較大，故在實(shí)際科研工作中較少使用。移植性肝癌模型操作繁雜，成功率依賴于技術(shù)的成熟性，因此較難獲得;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物肝癌模型制作技術(shù)要求極高，價(jià)格昂貴，國內(nèi)開展的尚較少;化學(xué)誘發(fā)性肝癌模型操作簡便，成本低，且能較好的模擬人類肝癌的自然病理過程，制作方法簡單，是最常用的建模方法之一(肝癌動(dòng)物模型的研究進(jìn)展。世界華人消化雜志，2011,19:1275-1278)?；瘜W(xué)誘發(fā)型肝癌模型最經(jīng)典方法的是將二乙基亞硝胺(DEN)溶于水中，給予小鼠自由飲用(Chemoprevent1n by Lipid-soluble TeaPolyphenols in DiethyInitrosamine/Phenobarbital-1nduced Hepatic Pre-cancerLes1n.Anticancer Res ,2014,34:683-693)，這樣的缺陷在于給藥劑量很難控制，小鼠順應(yīng)性差，個(gè)體差異大，死亡率高。
[0004]隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料因其具有靶向定位、緩釋控釋藥物、載藥量高、提高藥物吸收率等優(yōu)點(diǎn)而在藥物傳輸、癌癥治療、基因治療等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用(Codelivery of doxorubicin and curcumin with lipid nanoparticles results inimproved efficacy of chemotherapy in liver cancer.1nternat1nal Journal ofNanomedicine,2015,10:257-270)，但是利用其負(fù)面生物效應(yīng)，在疾病造模領(lǐng)域的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決【背景技術(shù)】中所存在的技術(shù)問題，本發(fā)明進(jìn)而提供了一種穩(wěn)定性強(qiáng)、耗時(shí)短以及致死率低的肝臟誘癌劑、肝臟誘癌劑的制備方法以及基于肝臟誘癌劑建立原發(fā)性肝癌模型的方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]一種肝臟誘癌劑，其特征在于:所述肝臟誘癌劑是二乙基亞硝胺(DEN)非水溶液。
[0008]作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的肝臟誘癌劑是DEN油溶液。
[0009]作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的肝臟誘癌劑是DEN麻油溶液。
[0010]作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的肝臟誘癌劑是納米化的DEN油溶液。
[0011]作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的納米化的DEN油溶液中的DEN的含量不低于20.625mg.ml—1O
[0012]作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的納米化的DEN油溶液中的DEN的含量是20.625mg.ml—1-41.25mg/ml—、
[0013]—種用于制備如上所述的肝臟誘癌劑的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟:
[0014]I)將DEN以及蛋黃卵磷脂溶于麻油中，制備得到油相;所述DEN的終濃度是10.97%V/V-21.94%V/V;所述蛋黃卵磷脂的終濃度是6%W/V;
[0015]2)將Tween 80以及甘油溶于超純水中，制備得到水相;所述Tween 80的終濃度是1.25 % V/V;所述甘油的終濃度是2.81 % V/V;
[0016]3)在60°C恒溫水浴的條件下，將步驟I)制備得到的油相滴入步驟2)制備得到的水相中，在1200r/min的條件下攪拌15miη;所述油相與水相的體積比是1:4;
[0017]4)在1000rpm的條件下高剪切2min，最終得到粒徑是100nm-200nm的乳化顆粒；
[0018]5)在100bar的條件下高壓均質(zhì)5次即得到納米化的DEN油溶液。
[0019]—種基于如上所述的肝臟誘癌劑的建立原發(fā)性肝癌模型的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟:
[0020]I)選用6-8周齡SPF級(jí)雄性昆明KM小鼠，體重18_22g，飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境I周；
[0021]2)每周按雄性昆明KM小鼠的體重經(jīng)口給予前述的肝臟誘癌劑，連續(xù)造模20周，建立小鼠原發(fā)性肝癌模型；
[0022]3)模型鑒定。
[0023]作為優(yōu)選，當(dāng)步驟2)中采用肝臟誘癌劑是DEN麻油溶液時(shí)，所述步驟2)中按雄性昆明KM小鼠的體重經(jīng)口給予如前所述的肝臟誘癌劑的給藥劑量是16.5mg/kg;給藥頻率是每周I次、3次或7次。
[0024]作為優(yōu)選，當(dāng)步驟2)中采用的肝臟誘癌劑是納米化的DEN油溶液時(shí)，所述步驟2)中按雄性昆明KM小鼠的體重經(jīng)口給予如前所述的肝臟誘癌劑的給藥劑量是8.25mg/kg;給藥頻率是每周I次。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0026]本發(fā)明涉及一種肝臟誘癌劑、制備方法以及基于肝臟誘癌劑的建立小鼠原發(fā)性肝癌模型的方法，選用6-8周齡SPF級(jí)雄性KM小鼠，每周按體重經(jīng)口給予誘癌劑DEN，連續(xù)造模20周，建立小鼠原發(fā)性肝癌模型。本發(fā)明通過改變DEN劑型及給藥頻率，成功建立小鼠原發(fā)性肝癌模型，該模型具有模型制作成功率高、造模過程中動(dòng)物死亡率低，高劑量DEN麻油(I次/周)組小鼠的死亡率為25%，存活12只小鼠中有5只肉眼可見腫瘤結(jié)節(jié)，肝癌發(fā)生率為31.25% ;光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，DEN水溶及高劑量DEN麻油組小鼠，明顯可見具有被膜形成的結(jié)節(jié)灶，細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，大小、形態(tài)各異，染色質(zhì)明顯增粗，胞質(zhì)豐富，可見病理性核分裂像，分化較差的肝細(xì)胞內(nèi)可見巨核，表明細(xì)胞異型性明顯;低劑量DEN麻油組出現(xiàn)肝細(xì)胞變性壞死、炎細(xì)胞浸潤、大量空泡脂肪變性，而DEN納米微乳組則明顯可見具有被膜形成的結(jié)節(jié)灶，細(xì)胞大小、形態(tài)不一，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，可見瘤巨細(xì)胞，核分裂像明顯。本方法簡單易行，造模實(shí)驗(yàn)周期短，可建立理想的肝癌動(dòng)物模型；將DEN納米化后，能增強(qiáng)DEN對肝臟的損傷作用，提供了一種更短時(shí)間內(nèi)建立原發(fā)性肝癌動(dòng)物模型的理論基礎(chǔ)。本發(fā)明通過將DEN溶于麻油經(jīng)口給藥增加了小鼠服藥的順應(yīng)性，克服了 DEN水溶造模小鼠之間的個(gè)體差異;在二十周時(shí)，DEN水溶組及經(jīng)口高劑量組小鼠肉眼均可見腫瘤結(jié)節(jié)，但I(xiàn)次/周經(jīng)口給藥組小鼠死亡率最低，即長期低頻給藥能大大降低造模過程中的死亡率。使用DEN油溶液建立原發(fā)性肝癌模型具有以下優(yōu)勢:①穩(wěn)定性強(qiáng);②操作簡方便;③動(dòng)物順應(yīng)性增加，死亡率降低?；谀壳凹{米技術(shù)的發(fā)展，本發(fā)明采用納米化DEN長期低頻給藥。研究發(fā)現(xiàn)，與較低劑量DEN油溶液給藥對照，利用納米制劑靶向和緩釋的原理使納米化的DEN對肝臟的損傷增強(qiáng)。
【附圖說明】
[0027]圖1A為造模過程中在第O、5、1、15、20周時(shí)各組小鼠體重變化示意圖；
[0028]圖1B是造模過程中第20周時(shí)各組小鼠體重變化示意圖；
[0029]圖2為實(shí)施例1_3中誘癌過程中小鼠死亡率不意圖；
[0030]圖3為實(shí)施例1-3中二十周時(shí)各組小鼠肝臟肉眼觀照片；
[0031]圖4為實(shí)施例4中二十周時(shí)各組小鼠肝臟組織病理學(xué)觀照片。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)理解，以下內(nèi)容不應(yīng)以任何方式對本發(fā)明的保護(hù)范圍加以限制。
[0033]針對上述常用的肝癌動(dòng)物模型建立中的穩(wěn)定性差、耗時(shí)長、死亡率高等問題，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供了一種建立小鼠原發(fā)性肝癌模型的優(yōu)化方法。
[0034]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供了長期低頻誘導(dǎo)原發(fā)性肝癌模型的方法，改善傳統(tǒng)化學(xué)誘導(dǎo)肝癌模型的死亡率高等問題。
[0035]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供了納米化DEN(nano-DEN)作為一種更好的原發(fā)性肝癌誘導(dǎo)劑的理論基礎(chǔ)。
[0036]本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思如下:
[0037]化學(xué)誘導(dǎo)型肝癌模型是研究肝癌最好的模型之一，DEN是迄今應(yīng)用最廣泛的一種化學(xué)誘導(dǎo)型肝癌模型制劑(Molecular pathology of early stage chemically inducedhepatocaricinogenes.Pathol Int，2009，59:605-622)。并且亞硝胺類化合物普遍存在于谷物、牛奶、干酪、煙酒、熏肉、烤肉、海魚、罐裝食品以及飲水中(食物中N-亞硝基化合物與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展.中華腫瘤防治雜志，2008，15:151-155)。傳統(tǒng)造模方法將DEN溶于水中，給予小鼠自由飲用，但是往往實(shí)驗(yàn)周期比較長，個(gè)體差異大，且死亡率高(化學(xué)性藥物誘發(fā)肝癌模型的研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)研究雜志，2009,38:12-14)。實(shí)驗(yàn)過程中，由于多種條件的限制，尤其是實(shí)踐方面，死亡率方面的制約，亟需優(yōu)化出更好、更快的造模方法。
[0038]為了更好地模擬人們可能因長期接觸環(huán)境中有毒、有害化學(xué)物質(zhì)，以及長期服用肝毒性藥物造成肝臟損傷甚至肝癌的情況，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立了低劑量DEN麻油組及nano-DEN