2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氫-1h-咪唑在制備抗神經(jīng)退化性疾病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種西苯挫嘟化合物在制藥中的應(yīng)用，尤其設(shè)及一種2-(2，2-二苯基 環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫在制備抗神經(jīng)退化性疾病藥物中的應(yīng)用。屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)，又稱老年性癡呆,是一種中樞神經(jīng)退 化性疾病。患有阿爾茨海默病的病人表現(xiàn)出漸進性記憶、認知功能下降，并伴有行為上W及 精神上的癥狀;其人格的改變W及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀會嚴重影響社交、職業(yè)與生活 功能。
[0003] 自隧是一種特定的廣泛存在于從果蛹、酵母到高等脊椎動物的真核細胞中的生命 現(xiàn)象，是長命蛋白和胞質(zhì)細胞器降解的主要細胞代謝通路，W細胞質(zhì)、液泡在溶酶體的退化 過程為主要特征。自隧作用主要包括了S種類型：微自隧（microautophagy)、巨自隧 (macroautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自隧（chaperone-mediated autophagy)。其中，巨自 隧在神經(jīng)退行性疾病病變中的作用尤為受到關(guān)注。
[0004] 阿爾茨海默病中重要的神經(jīng)病理學(xué)標志是淀粉樣蛋白斑，神經(jīng)纖維纏結(jié)W及神經(jīng) 元的缺失?，F(xiàn)階段普遍認為，大腦中的定粉樣蛋白（AP)的積聚導(dǎo)致了神經(jīng)退行性病變，并最 終出現(xiàn)了慢性癡呆癥狀。
[0005] 近年來，自隧越來越多的被關(guān)聯(lián)到臨床疾病中，尤其是干擾性疾病、癌癥、神經(jīng)退 化疾病和自我免疫類疾病。神經(jīng)病理學(xué)證據(jù)顯示，自隧途徑與阿爾茨海默病是相禪連的。在 神經(jīng)細胞內(nèi)，通過化U蛋白過度憐酸化聚合形成了神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs),而細胞外，神經(jīng)斑 主要由AP的聚集組成。運些都是阿爾茨海默病的主要神經(jīng)病理學(xué)標記。另有證據(jù)顯示，在可 W發(fā)射信號的核內(nèi)體中包含神經(jīng)生長因子(NGF)，在顯微狀態(tài)下可W看到巧光標記的LC3能 夠逆向運輸NGF，由此可知神經(jīng)生長因子可能源于或與自隧體相關(guān)。在阿爾茨海默病中，細 胞自隧受到損傷，自隧體得W積累，核內(nèi)質(zhì)溶酶體途徑出現(xiàn)異常。而自隧的藥理學(xué)活化作用 可W促進AP的清除，進而減輕AD癥狀。所W自隧被認為是阿爾茨海默病的一種潛在的治療 方法。
[0006] 西苯挫嘟化合物是一類重要的咪挫類化合物，既可抑制化+通道，減少化+內(nèi)流，亦 可抑制Ca 2+通道，減少Ca2+內(nèi)流，減弱屯、肌收縮力。W往人們對它的研究主要集中抗屯、律失 常作用等多種生物效應(yīng)。而其在影響細胞自隧和神經(jīng)疾病方面的研究和應(yīng)用，經(jīng)權(quán)威機構(gòu) (Web of knowledge、Elsevier ScienceDirect等）檢索查新，目前國內(nèi)外未見報道。鑒于 此，研究和開發(fā)西苯挫嘟化合物的新用途特別是在制備抗神經(jīng)退化性疾病藥物中的應(yīng)用具 有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和目前臨床對神經(jīng)性變性病的治療需求，本發(fā)明要解決的問 題是提供一種2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫在制備抗神經(jīng)退化性疾病藥物中 的應(yīng)用。
[000引本發(fā)明所述2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫在制備抗神經(jīng)退化性疾病 藥物中的應(yīng)用。
[0009]其中：2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫的化學(xué)結(jié)構(gòu)如通式（I)所示，所 述神經(jīng)退化性疾病優(yōu)選是阿爾茲海默病。
[0011] 本發(fā)明運用野生型神經(jīng)膠質(zhì)細胞U87MG細胞及LC3被綠色巧光蛋白（GFP)轉(zhuǎn)染的神 經(jīng)膠質(zhì)細胞U87MG細胞(簡稱LC3-GFP-U87細胞），對咪挫類衍生物進行了在影響細胞自隧和 神經(jīng)疾病方面的研究，證實:所述化合物2-( 2，2-二苯基環(huán)丙基)-4，5-二氨-IH-咪挫在增強 細胞自隧方面具有明顯作用，并確定2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫能有效誘 導(dǎo)引發(fā)細胞自隧的濃度為如M。
[0012] 為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)及本發(fā)明所述化合物的作用，下面結(jié)合2-(2,2-二 苯基環(huán)丙基)-4，5-二氨-IH-咪挫的藥理實驗及結(jié)果，來進一步闡述其在增強細胞自隧中的 作用。
[0013] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的制備：W常規(guī)方法培養(yǎng)野生型神經(jīng)膠質(zhì)細胞U87MG細胞及LC3被 綠色巧光蛋白（GFP)轉(zhuǎn)染的神經(jīng)膠質(zhì)細胞U87MG細胞(簡稱LC3-GFP-U87細胞），收集生長狀 態(tài)良好的且處于對數(shù)期的細胞，備用。
[0014] 采用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法進行如下實驗，W觀察2-(2,2-二苯基環(huán)丙 基)-4,5-二氨-IH-咪挫對LC3-GFP-U87細胞和野生型神經(jīng)膠質(zhì)細胞U87MG自隧的影響。
[001引1).綠色巧光蛋白-自隧過程特征蛋白GFP-LC3方法檢測細胞內(nèi)自隧小體情況，W 判斷化合物對細胞自隧的影響
[0016] 將處于對數(shù)生長期的LC3-GFP-U87細胞接種于96孔板中，經(jīng)扣M的2-(2，2-二苯基 環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫作用2地后，用巧光倒置顯微鏡觀察LC3蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 實驗組較對照組出現(xiàn)大量巧光斑點，說明細胞產(chǎn)生自隧小體，LC3聚集在自隧小體內(nèi)，形成 巧光斑點，證明了自隧的發(fā)生(見圖1)。
[0017] 2).蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)分析濃度分別為化M，5iiM和IOiiM的2-(2,2-二苯 基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫作用于U87MG細胞24小時(雷帕霉素作為陽性對照）后的蛋白 表達量
[0018]根據(jù)蛋白水平的表達量變化，發(fā)現(xiàn)化合物濃度為扣M和IOiiM時，皆顯著上調(diào)了LC3 n的表達量，證實了自隧的發(fā)生，并確定2-(2，2-二苯基環(huán)丙基)-4，5-二氨-IH-咪挫能有效 誘導(dǎo)引發(fā)細胞自隧的濃度為如M(見圖2)。
[0019] 上述實驗數(shù)據(jù)W平均值±標準誤差表示，經(jīng)t檢驗，P<0.05，表示有明顯性差異。
[0020] 通過上述經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理的實驗數(shù)據(jù)及其結(jié)果，可W得到W下結(jié)論：
[0021] 本發(fā)明所述的化合物2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫能顯著引起細胞 自隧，實驗結(jié)果證實2-( 2，2-二苯基環(huán)丙基)-4，5-二氨-IH-咪挫有望在制備抗神經(jīng)退化性 疾病藥物中具有應(yīng)用。預(yù)示2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫有望成為選擇性誘 導(dǎo)細胞自隧W及有效治療阿爾茲海默病的有潛力藥物，具有廣闊的科研和臨床開發(fā)前景。
【附圖說明】
[0022] 圖1:LC3-GFP-U87細胞經(jīng)扣M的2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫化合物 處理2地，顯示LC3-GFP-U87細胞發(fā)生顯著自隧的照片。
[0023] 其中：A圖為溶劑處理的對照組，B圖為化M的2-(2,2-二苯基環(huán)丙基）-4,5-二氨-IH-咪挫化合物溶液處理的實驗組。
[0024] 圖2: U87MG細胞經(jīng)IiiM，5測和IOiiM的2-( 2，2-二苯基環(huán)丙基）-4，5-二氨-IH-咪挫化 合物分別處理2地，檢測顯示化合物濃度為扣M和IOiiM時，U87MG細胞中LC3 n的表達上調(diào)，細 胞發(fā)生自隧。（蛋白質(zhì)印跡法）。
【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明所述的2-(2,2-二苯基環(huán)丙基)-4,5-二氨-IH-咪挫購于Sigma Al化ich。所 述U87MG細胞和LC3-GFP-U87細胞