一種樺褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)組合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體設(shè)及一種枠褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)組合物及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[000^ 枠褐孔菌（Inonotus obliquus)屬真菌口（Eumycota)擔(dān)子菌亞口 (Basidiomycotina)層菌綱化ymenomycetes)非權(quán)菌目（Aphyl Iophorales)多孔菌科 (Polyporaceae)纖孔菌屬，俗稱枠癌褐孔菌、白枠茸、斜管纖孔菌，歐洲人稱之為chaga，是 一種藥用價(jià)值很高、應(yīng)用前景廣泛的真菌，可用于治療各種消化道癌癥、降血糖、防治艾滋 病、抗衰老、降血脂、降血壓，還能夠改善過敏體質(zhì)，增強(qiáng)免疫力。
[0003] 如今，為了得到營養(yǎng)特色不同和/或用途不同的枠褐孔菌產(chǎn)品，人們開始對枠褐孔 菌傳統(tǒng)的發(fā)酵方法進(jìn)行改進(jìn)或者創(chuàng)新，W期得到不同營養(yǎng)特色和/或不同用途的枠褐孔菌 產(chǎn)品。例如：中國專利申請CN201310651781.6公開了一種枠褐孔菌發(fā)酵物，該發(fā)酵物用于治 療糖尿病，其制備方法包括：W枠褐孔菌為發(fā)酵菌，按常規(guī)方法培養(yǎng)發(fā)酵所得，其中枠褐孔 菌由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、保藏，菌種編號為1511C0001AC(X51184,其中發(fā)酵 培養(yǎng)基，按重量體積比計(jì)(g/ml)，黃豆粉1-2.5%、葡萄糖0.5-3%、氨基酸0.05-0.5%、憐酸 二氨鐘0.1-0.5 %，其余為水，調(diào)節(jié)P冊.5-6.0，溫度25-28°C，培養(yǎng)8-12天后放罐收集菌絲 體，通過優(yōu)化的發(fā)酵條件生產(chǎn)獲得的具有更高藥效的發(fā)酵物。
[0004] 中國專利申請CN 201310055029.5公開了一種液體深層發(fā)酵生產(chǎn)枠褐孔菌免疫增 強(qiáng)活性物質(zhì)的工藝，包括枠褐孔菌菌種活化、枠褐孔菌液體菌種培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵及枠褐 孔菌免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)制備等主要步驟，其中，液體深層發(fā)酵:將液體菌種接入液體深層發(fā) 酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，液體菌種與液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:8-10,液體深層發(fā)酵 培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖30-32g/L，木質(zhì)纖維素32-38g/L，促進(jìn)劑0.9-lg/L，誘導(dǎo)劑3X1(T 5邑/1，蛋白腺3邑/1，皿2口04 1邑/1，211504*2也0 0.01邑/1，1(2冊04 0.4邑/1，化504*7也0 0.05邑/ 1，]\%504.7也0 0.5邑/1，〇1504.5也0 0.02邑/1，(：〇(：12 0.01邑/1，]\111504.也0 0.08邑/1，抑值 6.0;液體深層發(fā)酵的工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度27-28°C，發(fā)酵罐空氣流量0.5-1. Ovvm，發(fā)酵罐 內(nèi)部壓力0.1-0.25kg/cm3，攬拌轉(zhuǎn)速70-150轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵周期12-14天;枠褐孔菌免疫增強(qiáng) 活性物質(zhì)制備:將發(fā)酵產(chǎn)物過濾，獲得菌絲體和發(fā)酵液，將菌絲體超聲波破壁，干燥粉碎后 得菌絲體粉，將發(fā)酵液濃縮至原體積的30%-40%后得發(fā)酵濃縮液，按Ig菌絲體粉加30-40ml發(fā)酵濃縮液的比例，將菌絲體粉和發(fā)酵濃縮液混合均勻，干燥后得粉狀的枠褐孔菌免 疫增強(qiáng)活性物質(zhì)。該方法獲得的免疫增強(qiáng)活性物質(zhì)含量更高，活性更好，產(chǎn)品更利于工業(yè)化 應(yīng)用。
[0005] 如能開發(fā)新的枠褐孔菌產(chǎn)品及其制備方法，將可提高枠褐孔菌的應(yīng)用范圍及應(yīng)用 價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種枠褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)組合物，該組合物中活性成分的含量和活性 高，具有良好的降血脂功能。
[0007] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，根據(jù)枠褐孔菌的發(fā)酵特性，通過本發(fā)明特定的真菌發(fā)酵及特定的工 藝，能夠有效地將辣木葉和費(fèi)菜中的營養(yǎng)成分和有效成分進(jìn)行生物降解和轉(zhuǎn)化，有助于提 高最終產(chǎn)品中活性成分的含量和活性。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0009] -種枠褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)組合物的制備方法，包括步驟：
[0010] (1)取活化后的枠褐孔菌菌種接種到液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天-15天，離屯、收集第 一菌體;將第一菌體懸浮在含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中于18°C-30°C解育化-2化，離屯、收集 第二菌體;將第二菌體經(jīng)PBS緩沖液清洗干凈后重新懸浮于液體MRS培養(yǎng)基中，震蕩搖勻得 到第二菌體液，將第二菌體液接種到含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中于18°C-30°C再培養(yǎng)2天-20 天，得到枠褐孔菌種子液；
[0011] (2)取活化后的米根霉菌種接種到液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)化-3化，離屯、收集第S菌 體，將第S菌體懸浮在含化Cl的液體MRS培養(yǎng)基中于20°C-30°C解育0.化-1化，離屯、收集第 四菌體;將第四菌體經(jīng)PBS緩沖液清洗干凈后重新懸浮于液體MRS培養(yǎng)基中，震蕩搖勻得到 第四菌體液，將第四菌體液接種到含化Cl的液體MRS培養(yǎng)基中于20°C-30°C培養(yǎng)化-3化，得 到米根霉種子液；
[0012] (3)將步驟(2)的米根霉種子液接入米根霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在20°C-30°C培養(yǎng)3 天-30天，然后置于交變磁場環(huán)境中再培養(yǎng)5天-20天，培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)真空冷凍干燥、粉碎后得 米根霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物;所述米根霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有費(fèi)菜和辣木葉；
[OOU] (4)將步驟(3)的米根霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)亞臨界水萃取，得到米根霉發(fā)酵亞臨界萃 取物I，萃取后所剩的殘?jiān)?jīng)真空冷凍干燥后得到萃取剩余物n;
[0014] (5)將步驟(1)的枠褐孔菌種子液接入枠褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)pH值為3-7， 在15°C-25°C培養(yǎng)5天-25天，離屯、，得到枠褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物虹，所述枠褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng) 基中含有萃取剩余物n;
[0015] 所述枠褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)組合物為米根霉發(fā)酵亞臨界萃取物I和枠褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物 虹。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)行米根霉固態(tài)發(fā)酵時(shí)，直接采用經(jīng)含化Cl的液體MRS培養(yǎng)基兩步解育處 理的米根霉種子液，并向培養(yǎng)基中添加辣木葉和費(fèi)菜，能夠有效地將其營養(yǎng)成分和有效成 分進(jìn)行生物降解和轉(zhuǎn)化，有助于提高最終產(chǎn)品中活性成分的含量和活性。步驟(4)和步驟 (5)中，將米根霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行亞臨界水萃取，使萃取物中有效成分的活性得W最大程 度保留、含量得W大幅提高;再將萃取后的殘?jiān)鳛闁樅挚拙后w發(fā)酵主要的培養(yǎng)基，且采 用經(jīng)含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基兩步解育處理的枠褐孔菌種子液，通過一體化循環(huán)利用，使各 原料資源得到充分的利用，進(jìn)一步提高了最終產(chǎn)品中活性成分的含量和活性。
[0017]為了達(dá)到更好的效果，優(yōu)選：
[0018] 步驟（1)中，所述含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中膽鹽的質(zhì)量百分含量為0.0 5 % -0.5%。
[0019] 所述第一菌體與用于懸浮第一菌體的含膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基的體積比為1:1-3， 第二菌體與用于懸浮第二菌體的液體MRS培養(yǎng)基的體積比為1:1-3,第二菌體液的接種量為 5%。
[0020] 步驟(2)中，所述含NaCl的液體MRS培養(yǎng)基中NaCl的質(zhì)量百分含量為0.5 % -8 %。 [0021 ]所述第S菌體與用于懸浮第S菌體的含化Cl的液體MRS培養(yǎng)基的體積比為1:1-3， 第四菌體與用于懸浮第四菌體的液體MRS培養(yǎng)基的體積比為1:1-3,第四菌體液的接種量為 3%。
[0022] 步驟(3)中，所述米根霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基每IL中含有4. Og-8.5g費(fèi)菜和0.2g-4.5g 辣木葉。所述米根霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由費(fèi)菜、辣木葉和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，所述發(fā)酵基礎(chǔ) 培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可采用市售產(chǎn)品，也可采用現(xiàn)有配制方法配制。 所述費(fèi)菜選用費(fèi)菜全株。
[0023] 所述米根霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括:將新鮮費(fèi)菜、辣木葉在自來水下沖 洗干凈，驚干，切碎;再將4. Og-8.5g費(fèi)菜和0.2g-4.5g辣木葉用發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至IL， 混合均勻，pH值自然，得到米根霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0024] 所述米根霉種子液的接入量為米根霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%-25%。
[0025] 目前真菌發(fā)酵技術(shù)普遍存在發(fā)酵周期長、菌絲生長萌發(fā)慢、特征次生代謝代謝產(chǎn) 物含量低等問題。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將變磁場處理技術(shù)應(yīng)用于固態(tài)發(fā)酵中，通過特定培養(yǎng)時(shí)期的 適當(dāng)處理等外界因素有效刺激，提高真菌菌絲在費(fèi)菜和辣木葉培養(yǎng)基料上的生長代謝，縮 短發(fā)酵時(shí)間，有效促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的生成。所述交變磁場環(huán)境中磁場強(qiáng)度為〇.2mT-6mT， 磁場頻率為3Hz-40化。
[0026] 步驟（4)中，所述亞臨界水萃取的條件為：水料質(zhì)量比為10-50:1，萃取壓力在 4MPa-25MPa，萃取溫度為100°C-180°C，萃取時(shí)間為10min-90min。
[0027] 步驟(5)中，所述枠褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基每IL中含有0.2g-lg萃取剩余物n。所 述枠褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基由萃取剩余物n和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，所述的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng) 基采用本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可采用市售產(chǎn)品，也可采用現(xiàn)有配制方法配制。 [00%] -般發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基由W下質(zhì)量百分比的組分組成：葡萄糖1%-3%、K油P〇4 0.1%-〇.2%、MgS〇4 0.05%-0.1%和余量的水。
[0029] 所述枠褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法，包括:將0.2g-ig萃取剩余物n用發(fā)酵 基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至1L，混合均勻，pH值自然，得到枠褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0030] 所述枠褐孔菌種子液的接入量為枠褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3%-20%。
[0031] 所述枠褐孔菌菌種可采用現(xiàn)有任意一種枠褐孔菌菌種，可采用市售產(chǎn)品，例如:枠 褐孔菌（Inono化S obiiquus)菌種，購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。
[0032] 所述米根霉菌種可采用現(xiàn)有任意一種米根霉菌種，可采用市售產(chǎn)品，例如:米根霉 (化izopus oryzae)ACCC 30416菌種，購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、。
[0033] 所述液體MRS培養(yǎng)基采用本領(lǐng)域常規(guī)的液體MRS培養(yǎng)基，可采用市售產(chǎn)品，也可采 用現(xiàn)有配制方法配制。一般液體MRS培養(yǎng)基的組成為:蛋白腺10.Og、牛肉浸膏10.Og、酵母浸 膏5.Og、葡萄糖20.Og、乙酸鋼5. Og、巧樣酸氨二