g，葡萄糖20g，M gS化1. Og，蛋白陳5. Og，瓊脂20g，水 加至1000 ml，自然抑。培養(yǎng)條件:28±rC培養(yǎng)3~4天，菌落直徑32~36mm，7-9天長(zhǎng)滿整個(gè)培 養(yǎng)皿;菌絲白色，拉狀，不易挑取;菌落干燥，不透明，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密。
[0068] 本發(fā)明所述的白黃小脆柄茹(Psathyrella candolleana)抓F15,其產(chǎn)酶篩選培養(yǎng) 基（即產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基）組成為:簇甲基纖維素鋼(CMC-Na)20g，蛋白腺lOg，酵母粉5g， 化C15g，K此P〇4 1. Og，MgS〇4.7此0 0.2g，瓊脂20g，蒸饋水1000 ml，自然pH。產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基： PDA-愈創(chuàng)木酪(0.04 % )培養(yǎng)基。
[0069] 本發(fā)明所述的白黃小脆柄茹(PsathyrelIa candolleana)BDF15的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng) 基組成為:葡萄糖20邑，教皮20邑，牛肉膏5.0邑，1(出口04 3.0邑，1邑504*7出0 1.5邑，硫酸銅0.2邑， 加水至1000 ni;搖瓶培養(yǎng)5~6天，培養(yǎng)溫度28±rc;發(fā)酵培養(yǎng)特征:培養(yǎng)第1天，未見明顯生 長(zhǎng)現(xiàn)象，培養(yǎng)第2天，有菌絲球出現(xiàn)，4天后培養(yǎng)液中白色菌球數(shù)量增多，直徑變大;培養(yǎng)第5-6天，菌絲球數(shù)量達(dá)到最大量，到了 7~9天，菌絲球集結(jié)，發(fā)酵液顏色變黃。
[0070] 菌株抓F15在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28±rc振蕩培養(yǎng)5~6d后，產(chǎn)生豐富的木質(zhì)纖維素復(fù) 合降解酶，該復(fù)合酶包括纖維素降解酶(FPA，CM化se，Cl酶，0-葡萄糖巧酶）、木質(zhì)素降解酶 漆酶W及果膠酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶等輔助酶。酶活力分別為：FPA53.26U/ml， CMCase 73.35U/ml，Cl酶52.22U/ml，(6-葡萄糖巧酶68.2洲/ml，漆酶452.84U/ml，果膠酶 13.4抓/ml、木聚糖酶27.21U/ml、蛋白酶45.52U/ml、淀粉酶12.54U/ml，發(fā)酵液經(jīng)8層紗布過 濾后，500化? min-i離屯、5min，取上清液即為復(fù)合酶粗制劑。
[0071] 下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)說明本發(fā)明的有益效果：
[0072] 1.復(fù)合酶提取時(shí)的反應(yīng)條件對(duì)提取丹酪酸類成分的影響 [007引（1)溫度
[0074] 由圖1可知，白花丹參莖葉中總丹酪酸含量在20°C~40°C范圍內(nèi)隨溫度的升高而 增大，但溫度在50°C~60°C之間時(shí)，總丹酪酸含量有所下降，考慮到溫度太高會(huì)導(dǎo)致酶失 活，影響提取效果運(yùn)一因素，因此選定30°C、40°C、50°C進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化提取實(shí)驗(yàn)。
[0075] (2)酶料比(發(fā)酵液量:投料量）
[0076] 隨著酶料比的增加，酶法提取的總丹酪酸也隨之增加，尤其酶料比在5:1~20:1時(shí) 增加得較快，在20:1~25:1范圍內(nèi)，總丹酪酸含量的增加趨于平緩（圖2)，因此選擇酶料比 為10:1、15:1、20:1進(jìn)行響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取實(shí)驗(yàn)。
[0077] (3)酶解時(shí)間
[0078] 隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，所得總丹酪酸含量也隨之升高，酶法提取的總丹酪酸在 15min~SOmin范圍內(nèi)變化度較大，在30min~60min范圍內(nèi)總丹酪酸含量顯著下降（圖3)。因 此選擇酶解時(shí)間15min、30min、45min進(jìn)行響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取。
[0079] 2、響應(yīng)曲面法優(yōu)化總丹酪酸含量的提取
[0080] 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)曲面因子及水平見表1。響應(yīng)面法操作過程共設(shè)計(jì) S因素 S水平共17次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(表2)，應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行 多元回歸擬合，得到溫度、酶料比、酶解時(shí)間與總丹酪酸含量之間的高次多項(xiàng)回歸方程:總 丹酪酸的提取率Y= 10.81-0.057A-0.080B+0.067C+0.092AB+0.062AC-0.13BC-1.78A2-1.8 她 2-1.16C2。
[0081] 表1響應(yīng)曲面因素水平表
[0083]表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

[0086]表3響應(yīng)面法對(duì)總丹酪酸含量的ANOVA分析結(jié)果
[008引經(jīng)表3響應(yīng)面法對(duì)總丹酪酸含量的ANOVA分析結(jié)果，得Xl、X2、X3及各因素之間的交 互作用對(duì)白花丹參中總丹酪酸含量的影響效應(yīng)。本研究設(shè)計(jì)范圍內(nèi)回歸方程顯著性檢測(cè)P < 0.0001，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;失擬項(xiàng)Lack Of Fit的P>0.05,該模型沒有失擬因 素存在;A2、B2對(duì)總丹酪酸含量的曲面效應(yīng)非常顯著(P<0.01)，因素 AB、AC、BC間相互作用均 不顯著（P>0.05)，由此得出各因素之間的交互作用對(duì)白花丹參中總丹酪酸提取有重要影 響。
[0089] 從圖4至圖9中可W看出，極值條件在圓屯、處，由Design-Expert軟件得到優(yōu)化條件 的處理，確定最優(yōu)提取工藝為:溫度40°C，酶料比15:1，酶解時(shí)間30min。
[0090] 3、復(fù)合酶提取法與傳統(tǒng)水提法對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0091] 為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，又考慮到實(shí)際操作的便利，根據(jù) 響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳條件，再提取總丹酪酸3份進(jìn)行平行驗(yàn)證試驗(yàn)(表4)，并與傳統(tǒng)水提 法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)曲面法優(yōu)化的提取條件實(shí)測(cè)的總丹酪酸提取率為11.03%，預(yù) 測(cè)值為11.25%，利用水提法丹酪酸的提取率為6.38%，提取率提高了42.2%。
[0092] 表4復(fù)合酶法提取丹參莖葉總丹酪酸驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
[0094]上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范 圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍W內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種丹參莖葉中丹酚酸類成分的提取方法，其特征是:包括復(fù)合酶提取和水浸提，所 述復(fù)合酶為白黃小脆柄燕(Psathyrella candolleana)BDF15發(fā)酵產(chǎn)生的粗酶液，所述白黃 小脆柄燕(？8&1:115^611&〇&11(1〇116&11&)130?15已于2015年11月4日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 11415。2. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:還包括:將上述提取得到的提取液減壓濃 縮，得丹參莖葉酚酸類成分濃縮液，將濃縮液再經(jīng)冷凍干燥，即得到丹參莖葉中丹酚酸類成 分提取物。3. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:所述丹參莖葉在進(jìn)行復(fù)合酶提取前首先進(jìn) 行干燥處理，然后粉碎成30-50目的粉末。4. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:所述復(fù)合酶提取時(shí)的復(fù)合酶粗酶液和丹參 莖葉的質(zhì)量體積比（g/ml)為15:1 -20:1。5. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:所述復(fù)合酶提取時(shí)的酶解溫度為30-50°C。6. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:所述復(fù)合酶提取時(shí)的酶解時(shí)間為0.5-1小 時(shí)。7. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:所述復(fù)合酶提取時(shí)的pH值為4.5-5.0。8. 如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征是:所述水浸提取時(shí)將復(fù)合酶提取后的混合液 中加入粗酶液體積倍數(shù)為40-60倍的水，40-60°C提取80-100°C收集濾液。9. 如權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征是:所述減壓濃縮的溫度為40-50°C。10. 如權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征是:所述冷凍干燥的條件:真空度135bar，溫 度-45〇C。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種丹參莖葉中丹酚酸類成分的提取方法，其特征是：包括復(fù)合酶提取和水浸提，所述復(fù)合酶為白黃小脆柄菇(Psathyrella？candolleana)BDF15發(fā)酵產(chǎn)生的粗酶液，所述白黃小脆柄菇(Psathyrella？candolleana)BDF15已于2015年11月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC？No.11415。本發(fā)明的提取方法可有效地促進(jìn)丹參莖葉中酚酸類成分的釋放，提高提取率，降低生產(chǎn)成本；并且本發(fā)明生產(chǎn)過程中不產(chǎn)生有害物質(zhì)，無污染，產(chǎn)品質(zhì)量好，功效強(qiáng)，同時(shí)還綜合利用中藥廢棄物，變廢為寶，是一種環(huán)境友好的綠色提取方法。CGMCC No.1141520151104
【IPC分類】A61K36/537
【公開號(hào)】CN105535100
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610016850
【發(fā)明人】李艷玲, 常正堯, 史仁玖, 張顯忠
【申請(qǐng)人】泰山醫(yī)學(xué)院
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月11日