一種用于治療腎病及心血管疾病的水蛭小肽有效部位組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有治療腎病及心血管病的水蛭小肽有效部位藥物組合物及其 制備方法，具體地說包含從水蛭中提取的水蛭小肽有效部位組合物及其制備方法，屬于中 藥領域。
【背景技術】
[0002] 腎病，腎臟的各種病癥。腎臟病的常見癥狀有水腫、高血壓、尿少或無尿、多尿、尿 頻、血尿、尿中泡沫增多、腰酸痛及其他一些全身性癥狀。治療腎病主要采取以下手段:保護 腎單位、控制低蛋白血癥、水腫和高脂血癥、修復腎細胞。腎臟病是一種疑難病，病程較長， 纏綿不愈，進展緩慢，治療比較困難，患者必須堅持不懈地服藥，即使已取得較好的療效，鞏 固治療至少也要一兩年以上。且患者青少年化趨勢嚴重。難治的腎病，需要的時間應更長。 由于傳統(tǒng)治療治標不治本，絕大多數腎病患者會出現"控制住了再復發(fā)，復發(fā)了再控制"的 反復過程，最終導致慢性腎功能不全。腎病的中醫(yī)辨證可分為6種類型，表現為虛象的，常見 有氣虛型、陽虛型、陰虛型，表現為實象的，常見有風水型、濕熱型、淤阻型。雖然有部分研究 表明，良好的血糖、血壓、血脂管理和使用血管緊張素轉化酶抑制劑或血管緊張素受體拮抗 劑可以延緩其進展。但到目前力止，仍未有公認的可以防冶腎病的有效萬法。中醫(yī)治療，尤 其是中藥方劑在中被廠泛地用于腎病。當前一些研究也表明中醫(yī)藥療法能改善腎病患者臨 床癥狀、減少尿蛋白排泄、改善腎功能、提高生存質量。長期的臨床實踐與研究證明，中醫(yī)藥 治療腎病具有一定優(yōu)勢。它通過辨證施治來修復腎組織，改善腎功能，使腎病得到控制。
[0003] 心腦血管疾病就是心臟血管和腦血管的疾病統(tǒng)稱，泛指由于高脂血癥、血液黏稠、 動脈粥樣硬化、高血壓等所導致的心臟、大腦及全身組織發(fā)生缺血性或出血性疾病，是一種 嚴重威脅人類，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，即使應用目前最先進、完善的治療 手段，仍可有50%以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理，全世界每年死于心腦血管疾 病的人數高達1500萬人，居各種死因首位。因此，掌握心血管病的預防及治療方法以及研發(fā) 新的有效藥物具有非常重要的意義。目前對于心血管病的患者主要是采用西藥治療，時常 復發(fā)，經常服用，會引起中毒，且經常服用機體會產生抗藥性，需加大劑量，而加大劑量會引 起中毒。
[0004] 水蛭，俗名螞蟥，在《神農本草經》中已有記載，具有很高的藥用價值;在內陸淡水 水域內生長繁殖，是中國傳統(tǒng)的特種藥用水生動物，其干制品泡制后中醫(yī)入藥，具有治療中 風、高血壓、清瘀、閉經、跌打損傷等功效。近年新發(fā)現水蛭制劑在防治心腦血管疾病和抗癌 方面具有特效。現代藥理研究表明，動物類藥材發(fā)揮作用的主要為其小肽類成分，本發(fā)明中 采用仿生酶解的方法，將水蛭中的大分子蛋白酶解成水溶性的小分子肽，所得的酶解液同 時具有抗凝及纖溶活性，活力強，可大程度提高生物利用度，降低毒副反應發(fā)生率。本發(fā)明 用水蛭小肽、黃芪總皂苷、當歸總皂苷和丹參總皂苷互作配伍，相互促進，不僅可充分發(fā)揮 藥效，避免西藥帶來的不良反應，而且服用劑量小，比中藥復方更好的治療腎病和心血管 病。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種具有治療腎病和心血管病的中藥有效部位組合 物； 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述中藥組合物的制備方法和用途。
[0006] 本發(fā)明的第一目的：以水蛭小肽、黃芪總皂苷、當歸總酚酸和丹參總酚酸為原料， 加入適當藥用輔料，制成相關的劑型。
[0007] 本發(fā)明藥物的組合物的原料藥的組成及配比為：水蛭小肽3~9重量份、黃芪總皂 苷2~8重量份、當歸總酸酸3~5重量份、丹參總酸酸2~4重量份。
[0008] 本發(fā)明中藥藥物組合物優(yōu)選的組成及配比為：水蛭小肽6重量份;黃芪總皂苷5重 量份;當歸總酸酸4重量份;丹參總酸酸3重量份。
[0009] 上述水蛭小肽有效部位中水蛭小肽不低于提取物的50%，黃芪總皂苷有效部位中 黃芪總皂苷不低于提取物的90%，當歸總皂苷有效部位中當歸總酚酸不低于提取物的45%， 丹參總酚酸有效部位中丹參總酚酸不低于提取物的91%。
[0010] 該藥物組合物可以加入相應輔料，制成丸劑、片劑、顆粒劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑中 的任一種。然后可以再加入其他具有治療腎病和心血管疾病作用的有效部位、有效成分、化 學合成品或者半合成品，然后再加入相應輔料，制成丸劑、片劑、顆粒劑、硬膠囊劑、軟膠囊 劑中的任一種。
[0011] 本發(fā)明中藥組合物的制備方法包括以下步驟： ① 水輕小肽的制備:取水輕，適當粉碎，加10倍量水勾衆(zhòng)IOmin，加熱煮沸15min，放冷 至室溫，采用鹽酸調pH至2.0,然后加入底物量1%的胃蛋白酶，在40°C條件下酶解lh，然后采 用氫氧化鈉溶液調節(jié)pH至8.0，加入底物量1%的胰蛋白酶，在40°C條件下酶解3h，時時攪拌 并調節(jié)pH在8.0范圍內，酶解完畢后繼續(xù)升溫煮沸IOmin，放冷，離心收集上清液，調節(jié)pH在 7.0,加入1%的活性炭，攪拌均勻，濾過，濾液用截留相對分子質量為3kD的中空纖維膜進行 超濾，收集透過液，再以截留相對分子質量為200D的陶瓷膜進行納濾，收集未透過液，減壓 濃縮，干燥，得水蛭小肽;其中水蛭小肽的含量為70%; ② 黃芪皂苷的制備:稱取黃芪5kg，以萬能粉粹機粉將黃芪碎成長度為0.1~0.5cm，加 入IOBVpH值為3.5的酸水，提取3次，每次Ih，分次以濾紙過濾，合并濾液，將濾液濃縮至相對 密度為1.09，加入2BV95 %的乙醇，室溫靜置18h，取上清液，將上清液濃縮至相對密度為 1.05,即得清膏;將清膏加入DlOl型大孔樹脂柱中，（藥液以生藥材計與大孔樹脂體積比為1 :1)用IOBV的純水洗脫1次，再用5BVpH值為12的堿水洗脫1次，然后用15BV40 %的乙醇洗脫1 次，棄去洗脫液，最后用15BV70 %的乙醇洗脫1次，收集洗脫液，在100°C溫度下干燥12h，即 得到黃芪總皂苷;黃芪甲苷含量為65.50 % ; ③ 當歸總酚酸的制備:取適當粉碎的當歸藥材，加入12倍量70%的乙醇提取3次，每次 lh，合并提取液，離心，取上清液，減壓濃縮，干燥，得醇提物干粉，加水溶解，離心，取上清 液，用HCL調至PH為3,通過D-101大孔樹脂柱，然后用水洗至流出液無色，再用濃度為70%的 乙醇溶液以4mL/min的流速進行洗脫，收集醇洗液，揮干溶劑，干燥得提取物干粉，用等量的 乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用少量水洗滌萃取液，分取乙酸乙酯層，揮干溶劑，干燥得 當歸總酚酸;其中阿魏酸的含量為0.19%。
[0012]④丹參總酚酸的制備:丹參粗粉1000 g，加8倍量水80°C溫浸3次，每次1.0小時，濾 過。合并濾液離心(4000轉/分鐘）10分鐘，取上清液過D1400型大孔吸附樹脂柱，先用水洗至 糖檢測反應為陰性，改用20%乙醇洗脫10倍柱體積。用50%的乙醇洗脫，收集洗脫液，同時 分析測定洗脫液中丹酚酸A和丹酚酸B的含量，當丹酚酸A:丹酚酸B = 0.90~1.10:1時，收集 該部分洗脫液，60°C減壓濃縮洗脫液至無醇味;加鹽酸調節(jié)PH值至3，用洗脫液1.5倍量體積 的有機溶劑萃取4次，合并有機溶劑相;減壓濃縮萃取液至浸膏狀，60°C真空干燥6小時，得 淡黃色粉末，即丹參總酚酸;其中丹酚酸B的含量為:45.7% ; ⑤按照比例取上述水蛭小肽、黃芪總皂苷、當歸總酚酸和丹參總酚酸，不加輔料或加 入輔料，制成藥學上可以接受的劑型。
[0013] 增加:各樹脂的型號可以是DlOl型大孔樹脂，D1400型大孔樹脂。
[0014] 水蛭小肽的含量測定方法:Lorry比色法精密量取比伐蘆定對照品溶液0,0.2， 0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置具塞試管中，各加水至1.0 mL，再分別加堿性銅試液5mL，搖勻， 室溫放置lOmin，快速加入福林酚試液（取福林酚試劑貯備液1~2) 0.5mL，搖勻，室溫放置 30min，顯色后，照紫外-可見分光光度法，在650nm的波長處測定A;同時以0號管為空白。以 對照品溶液濃度與其相對應的A計算線性回歸方程，Y=I. 4835X+0.0787，r=0.999。另精密 取水蛭仿生酶解小肽0.4g，精密加水40mL，超聲處理(功率250W，頻率40Hz)30 min，濾過，精 密量取續(xù)濾液〇.3mL，同法測定。從線性回歸方程計算供試品溶液中蛋白濃度，并乘以稀釋 倍數，計算，即得。
[0015] 黃芪總皂苷的含量測定：對照品溶液的制備精密稱取經五氧化二磷干燥至恒重 的黃芪甲苷4.3 mg，加甲醇溶解定容至10 ml，制成每毫升含黃芪甲苷0.43mg的溶液，即得。 供試品溶液的制備取黃芪總皂苷樣品（過65目篩）lg，精密稱定，置索氏提取器中，加氯 40ml，加熱回流3h，棄去氯仿液，藥渣揮去氯仿，同濾紙筒移入具塞錐形瓶中，精密加入水飽 和的正丁醇50ml，密塞，放置過夜，超聲處理（功率250W，頻率50000Hz)30min，濾過，精密量 取25ml，蒸干，殘渣加水10ml，微熱使溶解，放冷，上已處理好的DlOl大孔吸附樹脂柱（內徑 1.5cm，長30cm，樹脂高度為12cm)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用700mVL乙醇50 ml洗脫， 收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。精密移取對 照品溶液0，100，200，300，400，500，600ul，分別加入7支干燥具塞試管中，水浴揮干溶劑，各 加入新鮮配制的50ml/L香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8 ml，于60°C恒溫水浴加熱 15min，取出，流水冷卻2 min，加冰醋酸5ml，搖勾，隨行試劑空白，照分光光度法試驗，在 560nm波長處測定吸收度。以吸收度為縱坐標，黃芪甲苷微克數為橫坐標，繪