[0139] 步驟一:為了生產(chǎn)蟲草真菌菌體細(xì)胞，將分離的CSX系列或HHX系列菌株(本實(shí)施例 選用CS-XlOO或皿X-100)首先在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。25°C下在馬鈴馨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)斜面或平板瓊脂培養(yǎng)基(見表a)上培養(yǎng)3天。
[0140] 步驟二：1升液體培養(yǎng)基(表b)裝入5升錐形瓶，在12rC消毒20分鐘后，接種3-6個(gè) 冬蟲夏草菌種斜板，然后在下列情況下生長(zhǎng):pH值5.5(接種前調(diào)節(jié)）、25°C、搖瓶旋轉(zhuǎn)速度 15化pm、培養(yǎng)時(shí)間36小時(shí)。
[0141] 步驟培養(yǎng)二級(jí)種子使用攬拌生物反應(yīng)器75升(或更大），發(fā)酵培養(yǎng)基(表C)裝液 量50升或W上，在12rc下消毒30分鐘，接種2升一級(jí)種子細(xì)胞(4%的接種量），生長(zhǎng)條件如 下:pH值5.5(接種前調(diào)節(jié)）；25°C ;通氣量：1:0.2-1:0.9體積/體積/立方米（1500-2700升/小 時(shí)每50公升液量）；攬拌速度:200巧m; 48小時(shí)。
[0142] 步驟培養(yǎng)蟲草真菌菌體細(xì)胞，使用800升(或更大)攬拌式反應(yīng)器，裝600升(或 75%)發(fā)酵培養(yǎng)基液量(見表C)接種50升或更多的二級(jí)種子(8%接種量）。發(fā)酵罐和培養(yǎng)基 接種前需在12rC下消毒30分鐘。生長(zhǎng)條件如下:pH值5.5; 25-29°C ;攬拌速度:200巧m;通氣 量:1:0.5-1:1.1體積/體積/立方米(18-36立方米/小時(shí)每600公升液量）；培養(yǎng)期:48小時(shí)。
[0143] 步驟四：當(dāng)菌體細(xì)胞成長(zhǎng)已達(dá)到其指數(shù)生長(zhǎng)后期，或已達(dá)到成倍繁殖的生產(chǎn)目的， 打開生物反應(yīng)器的底部閥口收獲全發(fā)酵物，然后經(jīng)過濾器過濾去除發(fā)酵殘液，獲得蟲草菌 體細(xì)胞，每600升發(fā)酵培養(yǎng)基獲得含15%干物質(zhì)的100公斤濕菌體。此處獲得的蟲草菌體細(xì) 胞是菌絲體和抱子的混合物。
[0144] 表a馬鈴馨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基
[0146] 表b搖瓶培養(yǎng)基
[0148]表C液體培養(yǎng)基
[0150]實(shí)施例3原色原味型蟲草真菌細(xì)胞護(hù)膚原料制劑的制備
[0151] 將含15%干物質(zhì)的50公斤活細(xì)胞蟲草真菌濕菌體放置于帶攬拌抽提器內(nèi)，加入50 升99%的食用酒精或工業(yè)酒精(含乙醇95%，改性甲醇5%)，在室溫下，W攬拌速率15化pm， 均勻攬拌4小時(shí)。抽提混合液先經(jīng)布袋粗濾，粗濾液再經(jīng)=層過濾，例如孔徑34微米 ADVANTEC濾紙?jiān)陧敳?、濾布居中、和4微米ADVANTEC濾紙?jiān)诘撞?，獲得67.5升澄清50 %酒精 抽提液。抽提混合液也可W直接用沉降式離屯、機(jī)，例如高速管式離屯、機(jī)，一步將濾液與濾渣 分離。
[0152] 將50%酒精抽提澄清液裝入真空濃縮器，在80°C下真空蒸發(fā)濃縮，首先完全除去 酒精，然后進(jìn)一步將抽提液濃縮得到3.8升含干物質(zhì)50 %的漿狀液體，命名為CordyS?-A濃 縮液。酒精經(jīng)過回收裝置回收重復(fù)使用。因?yàn)镃ordyS?-A含有較高的脂溶性物質(zhì)，其制劑形 態(tài)為濃縮液體。
[0153] 經(jīng)檢測(cè)，CordyS?-A的得率(CordyS?-A總固形物/蟲草真菌干細(xì)胞)在化％ W上。
[0154] 實(shí)施例4脫色脫味型蟲草真菌細(xì)胞護(hù)膚原料制劑的制備
[01W] 40公斤含15%干物質(zhì)的活細(xì)胞蟲草真菌濕菌體加40升99%酒精抽提后得到54升 含酒精過濾液，揮發(fā)去除酒精后濃縮得到含干物質(zhì)15%液體9升，然后加8%活性炭，置于攬 拌器中在80°C下攬拌45分鐘脫色，過濾后得到4.5升脫色液(含干物質(zhì)7%);脫色液進(jìn)一步 用冷凍干燥器干燥得到350克粉劑。獲得的脫色液或冷凍干粉命名為CordyS?-AD。由于蟲草 真菌細(xì)胞提取液含有大量的還原性成份，任何在25°C W上進(jìn)行濃縮或干燥處理均會(huì)讓制劑 再次大幅度增色。CordyS?-AD的制劑形態(tài)為稀釋液體或冷凍干粉。CordyS?-AD得率 (CordyS?-AD總固形物/蟲草真菌干細(xì)胞)為6 %。
[0156] 實(shí)施例5低蛋白質(zhì)脫色脫味型蟲草真菌細(xì)胞護(hù)膚原料制劑的制備
[0157] 植物或微生物的抽提物不可避免地含有蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)是潛在的皮膚過敏源。 眾多化妝品企業(yè)會(huì)對(duì)原料的蛋白質(zhì)含量做出限定。本發(fā)明試驗(yàn)了各類去除和降低蛋白質(zhì)的 方法W滿足客戶的需求。已試驗(yàn)的脫蛋白質(zhì)方法包括:物理法即膜分離和樹脂吸附、蛋白酶 水解、酸水解。
[0158] 物理法無法使用是因?yàn)樗鼘?duì)其他活性成份會(huì)造成較大損失W及高昂的加工成本。 對(duì)4種商業(yè)酸性、中性和堿性蛋白酶在最佳溫度下進(jìn)行4至8小時(shí)的水解實(shí)驗(yàn)表明，運(yùn)些蛋白 酶對(duì)降低蟲草真菌細(xì)胞提取物中蛋白質(zhì)含量幾乎沒有效果。最后發(fā)現(xiàn)pH 1硫酸水溶液在 80-85°C下水解4小時(shí)的效果最佳，在此條件下蟲草真菌細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)可W降低接近 10倍。
[0159] 小屯、緩慢地將786.75克濃硫酸加入15升水，配制成5.245 %稀硫酸溶液。將30公斤 含15%干物質(zhì)的活細(xì)胞蟲草真菌濕菌體放置于夾層加熱攬拌鍋內(nèi)，邊攬拌邊小屯、地加入15 升5.245%稀硫酸溶液，攬拌均勻后測(cè)定pH為1.0。開啟蒸汽夾層加熱至80-85°C，保持溫度 攬拌水解4小時(shí)。放冷后分五次加入碳酸巧1050克用于形成不可溶的硫酸巧，攬拌均勻后， 再分五次加入氨氧化鋼1200克，將水解液的pH值中和至5.5-5.8,或所需要的pH值。
[0160] 然后，水解液經(jīng)布袋粗濾除去粗渣獲得37.2升含固形物7.5%的粗濾液。此時(shí)，大 量的硫酸根通過硫酸巧被去除。在37.2升的粗濾液中加入1860克活性炭巧％)，80°C下在攬 拌鍋內(nèi)脫色反應(yīng)45分鐘，然后經(jīng)過孔徑1微米的濾紙過濾，或者沉降式離屯、機(jī)分離得到26升 含固形物6%的脫色澄清液，命名為CordyS?-皿稀釋液體。CordyS?-皿稀釋液體進(jìn)一步用 冷凍干燥得到1.7公斤冷凍干粉。CordyS?-皿得率(CordyS?-皿總固形物/蟲草真菌干細(xì) 胞)為34.6%W上。
[0161 ]實(shí)施例6W蟲草護(hù)膚原料作為唯一活性成份的護(hù)膚精華的制備
[0162] 將Cordy S?-皿稀釋液體(5 %固形物)800毫升中加入丙締酷鋼/丙締酷胺、丙二醇、 甘油、乙二胺四乙酸二鋼、2-苯氧基乙醇（防腐劑）、乙基己基(防腐劑）、香精，然后用去離子 水定容至1000毫升。將所有的原料攬拌至均勻，然后滅菌裝瓶獲得護(hù)膚精華。
[0163] 實(shí)施例7皮膚增白和增亮的人體臨床實(shí)驗(yàn)
[0164] 標(biāo)準(zhǔn)化臨床實(shí)驗(yàn)由權(quán)威認(rèn)證的第S方實(shí)驗(yàn)室-法國SPINC0NTR0L的泰國子公司 SPINC0NTR0L ASIA Co丄td.實(shí)施。
[0165] -共進(jìn)行了=次標(biāo)準(zhǔn)化臨床實(shí)驗(yàn)。第一次臨床實(shí)驗(yàn)主要測(cè)試不同蟲草真菌細(xì)胞提 取組份的皮膚增白/增亮效果;第二次臨床實(shí)驗(yàn)對(duì)最佳組份的不同濃度和脫色處理進(jìn)行比 較;第=次臨床實(shí)驗(yàn)是商業(yè)化產(chǎn)品之間的比較，即測(cè)試蟲草真菌細(xì)胞提取物為唯一活性 成份的的護(hù)膚精華液"與市場(chǎng)上知名美白護(hù)膚精華液之間的皮膚增白/增亮效果。
[0166] 1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則：
[0167] 雙盲試驗(yàn) [016引比較研究
[0169] W實(shí)驗(yàn)對(duì)象自身部位為基準(zhǔn)線(空白對(duì)照）
[0170] 2.實(shí)驗(yàn)方法和原理：
[0171] 2.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象:亞洲人、健康、女性、年齡介于18至65歲之間、所有皮膚類型、在兩只 前臂上沒有紋身和皮膚病、能夠全程參與實(shí)驗(yàn)、非化妝品敏感人±、非孕婦和哺乳期婦女、 過去1個(gè)月中在前臂上未使用美白/增亮/桂斑產(chǎn)品、過去24小時(shí)在測(cè)試部位未使用化妝品/ 護(hù)膚品、過去2個(gè)月中未使用過任何皮膚的藥物治療、等等。
[017。 2.2樣品前臂涂抹部位示意圖（參見圖2):
[0173] 2.3樣品涂抹處理方式:在內(nèi)前臂隨機(jī)確定五不同測(cè)試區(qū)域:左臂3個(gè)點(diǎn)，右臂2點(diǎn)， 并使用透明覆蓋紙(見示意圖）。實(shí)驗(yàn)對(duì)象被要求在實(shí)驗(yàn)期間避免太陽紫外線照射。如果不 能避免偶爾的曝光，他們被要求使用不低于SPF 15的防曬霜。實(shí)驗(yàn)對(duì)象被要求在實(shí)驗(yàn)期間 在前臂不使用任何其他類型的化妝品/護(hù)膚品，特別是美白/增亮/桂斑的產(chǎn)品。在實(shí)驗(yàn)室測(cè) 定TO和T+4周/28天的樣品重量，W確保適量地使用了試驗(yàn)樣品。
[0174] 2.4測(cè)試時(shí)間表:測(cè)試4周或28天期間內(nèi)樣品的效果
[0175] TO(開始時(shí)間）：
[0176] 在設(shè)定環(huán)境下進(jìn)行20分鐘的適應(yīng)調(diào)節(jié)。
[0177] 用比色計(jì)CR-撕0?測(cè)定內(nèi)前臂測(cè)試部位的皮膚顏色指標(biāo)。
[017引測(cè)試樣品稱重。
[0179] 分配測(cè)試樣品和實(shí)驗(yàn)對(duì)象聲明表格。監(jiān)督TO到T+4周/28天期間實(shí)驗(yàn)對(duì)象是否按樣 品涂抹處理(治療)的方法，每天涂抹一次。
[0180] T+4周/28天(終結(jié)時(shí)間）：
[0181] 檢查內(nèi)前臂皮膚質(zhì)量和要求。
[0182] 詢問實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
[0183] 收集實(shí)驗(yàn)對(duì)象聲明表格。
[0184] 測(cè)試樣品稱重。
[0185] 在設(shè)定環(huán)境下進(jìn)行20分鐘的適應(yīng)調(diào)節(jié)。
[01化]用比色計(jì)CR-3朋?測(cè)定內(nèi)前臂測(cè)試部位的皮膚顏色指標(biāo)。
[0187] 2.5實(shí)驗(yàn)原理:實(shí)驗(yàn)所采用的色度儀法的原理在于模擬人眼的顏色感知。色度儀法 使用S色靈敏度測(cè)量光，W對(duì)應(yīng)于人眼睛的敏感度。S色刺激值XYZ的概念來源于運(yùn)樣的理 論，即紅，綠和藍(lán)巧巾顏色組份構(gòu)成了眼睛所感知的顏色，W及所有的顏色被認(rèn)為是運(yùn)3個(gè)顏 色的混合。國際委員會(huì)（CIE)在1931年的定義用于計(jì)算=色值，即一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)觀察者擁有X (入)、y(A)和Z(A)的混合功能。
[0188] 顏色可分為其色調(diào)，亮度和飽和度。因此，任何顏色可W特征為一個(gè)幾何坐標(biāo)空 間，它可W幫助確定亮度、主導(dǎo)色、飽和度。由于存在不同顏色的多個(gè)空間，數(shù)學(xué)鏈可W使坐 標(biāo)從一個(gè)到另一個(gè)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。在顏色空間指標(biāo)1^3^6^中，1^^表示亮度，其衡量度從0為黑 色，到100為白色。色調(diào)和飽和度是由色度護(hù)的組合來表示。
[0189] 2.6儀器和測(cè)量:比色計(jì)CR-300*>(日本美能達(dá)）用于顏色測(cè)定。在測(cè)定前，需要在設(shè) 定環(huán)境下(20-24°C，相對(duì)濕度在40-60%之間）進(jìn)行20分鐘的適應(yīng)調(diào)節(jié)。
[0190] 2.7皮膚顏色參數(shù):下列參數(shù)來評(píng)估測(cè)試樣品對(duì)皮膚顏色產(chǎn)生的效果。
[0191] L*(白度）：表示從全黑(L* = 0巧Ij絕對(duì)白（L* = 100)的相對(duì)白度。
[0192] a*(紅-綠色軸）。
[0193] b*(黃-藍(lán)色軸）。
[0194] 計(jì)算5次連續(xù)測(cè)量的平均值。然后從W上S個(gè)坐標(biāo)，計(jì)算TO和T+4周/28天之間的W 下參數(shù):L*，a*，b*，ITA°。
[0195] ITA° =Arctg[化*-50 )/b*] . (180/31)，個(gè)人類型學(xué)的角度（Indi Vidual Typological Angle)。
[0196] Arctg = S角反正切函數(shù)。
[0197] 顏色參數(shù)的解讀:L*表示(皮膚）白；ITA°表示(皮膚)亮。所W，T0和T+4周/28天之 間的L*越大說明皮膚增白的程度越高，ITA°越大說明皮膚增亮的程度越高。
[0198] 3.人體臨床實(shí)驗(yàn)1:初步試驗(yàn)-真菌細(xì)胞組份與安慰劑對(duì)于皮膚白亮效果的比