一種還原敏感型多肽前藥納米膠束及其制備與應(yīng)用
【專利說明】
(一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)藥納米材料制備，特別涉及一種多肽前藥納米膠束的制備方法。
(二)
【背景技術(shù)】
[0002]智能響應(yīng)型載藥系統(tǒng)在癌癥治療中越來越引起人們的關(guān)注。載藥系統(tǒng)根據(jù)外界因素的變化如溫度、PH和場效應(yīng)等，自發(fā)做出響應(yīng)，從而達(dá)到人們預(yù)期可控的治療效果。
[0003]還原型谷胱甘肽(GSH)是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的含有巰基的生物小分子，還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)是體內(nèi)最主要的氧化還原對(duì)。在細(xì)胞內(nèi)外不同的環(huán)境中GSH/GSSG的含量存在顯著的差異。由于還原型輔酶II(NADPH)利谷胱甘肽還原酶的作用，細(xì)胞內(nèi)GSH濃度是細(xì)胞外環(huán)境的100-1000倍，從而使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境保持較強(qiáng)的還原性。此外，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中GSH濃度比正常組織至少高4倍，因此，比正常組織有更高的還原性。
[0004]多肽分子是基體內(nèi)重要的一類生物活性物質(zhì)。與蛋白質(zhì)比較，具有分子量小，制備容易，抗原性弱，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥研究和臨床應(yīng)用上越來越受到重視。由于小片段肽的低毒性、靶向性、無免疫原性、良好的生物相容性以及本身的治療作用等特點(diǎn)，同時(shí)腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)肽類受體的發(fā)現(xiàn)，使得一些短肽可被作為導(dǎo)向物，以配體-受體特異性結(jié)合的方式應(yīng)用于靶向藥物遞送系統(tǒng)。利用肽與其受體的特異性結(jié)合特性，將肽與藥物結(jié)合形成復(fù)合物，增加藥物在體內(nèi)的選擇性，減少藥物的毒副作用，為提高藥物的治療提供了可能性，顯示了良好的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。
[0005]點(diǎn)擊化學(xué)(ClickChemistry)由化學(xué)家巴里?夏普萊斯在2001年引入的一個(gè)合成概念，主旨是通過小單元的拼接，來快速可靠地完成形形色色的分子的化學(xué)合成。疊氮與炔基的這類反應(yīng)屬于點(diǎn)擊化學(xué)的范疇，其操作簡單，條件溫和，對(duì)氧氣和水不敏感，反應(yīng)具有立體選擇性，反應(yīng)效率高，副產(chǎn)物少，在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定。
[0006]藥物載體的制備過程，通常較為復(fù)雜、繁瑣，副產(chǎn)物較多而且很難除去。借助點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)簡便而又高效的制備藥物載體。在制備治療癌癥的前藥過程中，采用Click反應(yīng)可以快速高效的將兩種不同性質(zhì)的模塊化分子結(jié)合起來。
(三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的是克服【背景技術(shù)】存在的問題和缺陷，提供一種制備還原敏感型多肽前藥的方法，現(xiàn)有藥物載體的制備過程，通常較為復(fù)雜、繁瑣，副產(chǎn)物較多而且很難除去。本發(fā)明借助點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)簡便而又高效的制備藥物載體，即不同種類的藥物分子與不同種類的多肽化合物通過疊氮與炔基的環(huán)化實(shí)現(xiàn)不同特性化合物的高效鍵合，以制備具有不同功能性的多妝如藥。所制備的多妝如藥具有環(huán)境刺激響應(yīng)性，可以提尚治療效率，降低治療的毒副作用。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0009]本發(fā)明提供一種還原敏感型多肽前藥納米膠束，所述納米膠束以疏水藥物為內(nèi)核，以細(xì)胞穿膜肽為殼層，所述內(nèi)核與殼層通過還原敏感型雙硫鍵連接;所述還原敏感型多肽前藥納米膠束結(jié)構(gòu)通式為:K1Q-triaZOle-SS-D0X，K1Q為細(xì)胞穿膜肽序列，triazole為疊氮與炔基環(huán)化后的三唑五元環(huán)，DOX為疏水藥物，SS為連接細(xì)胞穿膜肽序列與疏水藥物的還原敏感型雙硫鍵。
[0010]進(jìn)一步，所述細(xì)胞穿膜肽由8?30個(gè)堿性氨基酸縮合而成，優(yōu)選10個(gè)氨基酸。
[0011 ]進(jìn)一步，所述氨基酸包括賴氨酸、精氨酸或組氨酸，優(yōu)選賴氨酸。
[0012]進(jìn)一步，所述疏水藥物包括阿霉素(DOX)、喜樹堿或紫杉醇，優(yōu)選阿霉素。
[0013]本發(fā)明還提供一種所述還原敏感型多肽前藥納米膠束的制備方法，所述方法為:
(I)DOX-SS-alkyne:將疏水藥物溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中，加入三乙胺、二硫代酸酐，20°C?70°C攪拌0.lh?4h后(優(yōu)選25°C攪拌反應(yīng)22min)，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和丙炔胺，室溫避光攪拌混勻，將混合液用去離子水沉淀，離心，沉淀干燥，得到DOX-SS-alkyne;所述疏水藥物與二硫代二丙酸酐、三乙胺物質(zhì)的量之比為1:0.5?1.5:1?1.2;所述疏水藥物與1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和丙炔胺的物質(zhì)的量之比為1:2?4: 2?4:4?6;所述二甲基甲酰胺體積用量以疏水藥物物質(zhì)的量計(jì)為100?130L/mol; (2)K1Q-triazole-SS-D0X:將步驟(I)制備的DOX-SS-alkyne和K10-N3加入二甲基甲酰胺中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入催化劑碘化亞銅，20°C?30°C反應(yīng)完全后(優(yōu)選25°C反應(yīng)24h)，將反應(yīng)液用0.005?0.020mol/L(優(yōu)選0.013!1101/10乙二胺四乙酸二鈉水溶液作為透析液進(jìn)行透析(優(yōu)選透析袋(1^(:0100Da)，通過乙二胺四乙酸二鈉與過渡金屬銅離子的絡(luò)合作用，以除去銅離子)，取截留液冷凍干燥，得到還原敏感型多肽前藥納米膠束K1Q-triazole-SS-D0X;所述Kiq-N3為末端連接疊氮的細(xì)胞穿膜肽序列;所述DOX-SS-alkyne與Kiq-N3物質(zhì)的量之比為1: 0.7?0.9;所述催化劑用量以DOX-SS-alkyne和Kiq-N3的物質(zhì)的量之和計(jì)為I %-6% ;所述二甲基甲酰胺體積用量以DOX-SS-alkyne質(zhì)量計(jì)為10?50ml/g ο
[0014]進(jìn)一步，優(yōu)選步驟(I)所述疏水藥物與二硫代二丙酸酐、三乙胺物質(zhì)的量之比為1:1?1.2:1?1.1 (最優(yōu)選1:0.96:1.03);所述疏水藥物與1_乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和丙炔胺的物質(zhì)的量之比為I: 3?4: 3?4:4.5?5.5(最優(yōu)選1:3.5:3.5:4.8)。
[0015]進(jìn)一步，優(yōu)選步驟(2)所述DOX-SS-alkyne與Kiq-N3物質(zhì)的量之比為1: 0.8?0.9(最優(yōu)選1:0.83);所述催化劑用量以DOX-SS-alkyne和Kiq-N3物質(zhì)的量之和計(jì)為3%-5% (最優(yōu)選 4.5%)0
[0016]進(jìn)一步，優(yōu)選步驟(2)所述Kiq-N3通過FMOC多肽方法合成:先合成側(cè)鏈帶有保護(hù)基的多肽序列，繼而利用同樣的方法加入氨基受FMOC保護(hù)之后的12-氨基十二酸，脫去12-氨基十二酸上的FMOC后，暴露出活性氨基，再加入疊氮乙酸，最后通過多肽固相合成方法合成Κ?Ο_Ν3，具體步驟是:
[0017](I)取樹脂于DMF中，攪拌、靜置溶脹，之后，抽干樹脂并用DMF洗滌，所述DMF的用量以樹脂質(zhì)量計(jì)為12?16ml/g。
[0018](2)稱取氨基受保護(hù)的賴氨酸FmOC-Lys(BOC)-0H、N，N-二異丙基乙胺(DIEA)溶于DMF，向樹脂加入后攪拌，反應(yīng)完成，抽干樹脂并用DMF洗滌。所述樹脂上活性點(diǎn)與Fmoc-Lys(Boc)-OH、DIEA的物質(zhì)量之比為1:0.6?0.8:0.012?0.015;01^的用量以樹脂質(zhì)量計(jì)為1ml?13ml/g。
[0019](3)向樹脂中加入DMF、MeOH和DIEA的混合液，反應(yīng)完成之后，抽干樹脂并用DMF洗滌。完成對(duì)未反應(yīng)活性Cl的封端。所述DMF的量以樹脂質(zhì)量計(jì)為4?10ml/g，Me0H的量以樹脂質(zhì)量計(jì)為2?5ml/g，DIEA的量以樹脂質(zhì)量計(jì)為0.06?1.5ml/g。
[0020](4)向樹脂中加入哌啶、DMF的混合液，反應(yīng)完成后，抽干樹脂并用DMF洗滌。完成FMOC保護(hù)基的脫除。所述DMF的量以樹脂質(zhì)量計(jì)為2.5?10ml/g，哌啶的量以樹脂質(zhì)量計(jì)為15?22ml/g0
[0021 ] (5)固相合成下一個(gè)賴氨酸:配制Fmoc-Lys (Boc)-0H、O-苯并三氮卩坐-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、DIEA的DMF混合液。向樹脂中加入混合液，攪拌反應(yīng)之后，抽干樹脂并用DMF洗滌。所述樹脂上活性點(diǎn)與FmOC-Lys(BOC)-0H、HBTU、H0BT的物質(zhì)量之比為1:3?5:7?9: 7?9 ;DIEA的量以樹脂質(zhì)量計(jì)為1.5?2ml/g，DMF的量以樹脂質(zhì)量計(jì)為2.5?10ml/go
[0022](6)茚三酮檢測:取微量樹脂與試管中，加入茚三酮甲醇溶液(茚三酮質(zhì)量濃度1%?5%)，加熱試管。如果茚三酮變成藍(lán)紫色，則說明第