一種抗鴨病毒性肝炎黃芪多糖磷酸化分子修飾法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗鴨病毒性肝炎黃芪多糖磷酸化分子修飾法，屬于中獸藥制備技 術(shù)領(lǐng)域。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨病毒性肝炎是鴨肝炎病毒(DHV)感染引起的一種傳播迅速、高發(fā)病率、高致死性 疫病。1949年首次分離到該病毒，目前已呈全世界范圍分布。DHV主要存在DHV-I及其變異 株、Duck Astrovirus以及DHV-3三個血清型，其中DHV-I型毒性最強(qiáng)、分布最廣，主要侵染3 周齡以內(nèi)的雛鴨，病死率高于80%，甚至可高達(dá)100%，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)主要病原之一。
[0003] 目前，世界范圍內(nèi)臨床上還沒有有效的抗DHV-I藥物，主要通過對種鴨或雛鴨注射 弱毒苗進(jìn)行免疫防御。臨床病例一旦出現(xiàn)，即造成難以挽回的損失。1958年Gerber等首先發(fā) 現(xiàn)海藻多糖具有抗病毒作用，此后多種多糖及硫酸化多糖的抗病毒作用陸續(xù)被報道。近年 來，本實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn)了黃芪、香菇、當(dāng)歸等多種中藥多糖能顯著抵抗新城疫、傳染性法氏囊 病等病毒的感染。中藥化合物結(jié)構(gòu)修飾是提高其水溶性和生物活性的主要手段之一。許多 學(xué)者發(fā)現(xiàn)，中藥多糖成分、皂苷等成分硫酸化或磷酸化分子修飾后，使其成酯化物，其水溶 性普遍增加，免疫藥理作用明顯增強(qiáng)。
[0004] 黃芪是一種經(jīng)典的補(bǔ)氣用中藥。大量的現(xiàn)代藥理學(xué)研究和普遍的臨床應(yīng)用結(jié)果表 明，黃芪多糖是其主要有效成分之一，具有良好的提高免疫的作用。雖然有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過 硫酸化修飾的硫酸化黃芪多糖對雞傳染性法氏囊病毒、豬繁殖呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病 毒等表現(xiàn)出良好的抑制作用。我們課題組發(fā)現(xiàn)，按照不同的條件修飾中藥多糖所獲得的多 糖成分分子修飾物的活性往往大相徑庭。為研究有效的抗鴨病毒性肝炎藥物，我們根據(jù)前 期的預(yù)試驗(yàn)，將分離獲得并經(jīng)在體試驗(yàn)驗(yàn)證有一定效果的黃芪多糖最有效部位采用磷酸化 分子修飾，并利用正交試驗(yàn)比較優(yōu)化了其制備工藝，以進(jìn)一步提高其生物活性和生物利用 率。
[0005] 本發(fā)明首次對黃芪多糖抗鴨病毒性肝炎有效部位進(jìn)行篩選和磷酸化分子修飾，并 采用正交法優(yōu)化了抗鴨病毒性肝炎黃芪多糖活性部位磷酸化分子修飾條件，發(fā)現(xiàn)磷酸化分 子修飾能顯著增加黃芪多糖有效部位抗鴨病毒性肝炎效果，提高其生物利用度，并獲得較 高的產(chǎn)物得率。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 技術(shù)問題本發(fā)明針對世界范圍內(nèi)臨床上還沒有有效的抗鴨病毒性肝炎藥物問題， 提供一種黃芪多糖抗鴨病毒性肝炎有效部位的磷酸化分子修飾方法，所獲得的黃芪多糖磷 酸酯PAPS 75含量達(dá)36.87 %，磷酸根含量為12.03 %，產(chǎn)物得率達(dá)130.32 %，且對鴨病毒性肝 炎的治療作用明顯提高，可望最終應(yīng)用于鴨病毒性肝炎的防治。
[0007] 技術(shù)方案
[0008] 采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位黃芪多糖，經(jīng)數(shù)次臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪多糖乙 醇濃度75 %醇沉部分(APS75)對鴨病毒性肝炎有較理想的治療效果，再用正交試驗(yàn)法對 APS75的磷酸化分子修飾方法進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化后的黃芪多糖抗鴨病毒性肝炎有效部位 (APS75)的磷酸化分子修飾方法為:精確稱取2.5000g三聚磷酸鈉和1.0 OOOg三偏磷酸鈉，溶 于50ml蒸餾水中；精密稱取250mg黃芪多糖有效部位APS75加入至100mL蒸餾水中，充分溶解 后將配好的三聚磷酸鈉-三偏磷酸鈉混合液50ml加入，調(diào)節(jié)pH = 7.5~9，置恒溫水浴鍋內(nèi)， 反應(yīng)溫度70°C~90 °C、反應(yīng)時間4~8h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物先用自來水透析48h，再用蒸 餾水透析24h，冷凍干燥后得磷酸化黃芪多糖。經(jīng)Nicolet FT-IR 200型傅立葉變換紅外光 譜儀分析為黃芪多糖磷酸酯pAPS75。按此方法制備的黃芪多糖磷酸酯含量達(dá)36.87%，磷酸 根含量為12.03%，產(chǎn)物得率達(dá)130.32%。所獲得的黃芪多糖磷酸酯對鴨肝炎病毒DHV-I感 染體外培養(yǎng)的鴨胚肝細(xì)胞具有良好的抑制作用，對鴨肝炎病毒DHV-I攻毒感染引起的鴨病 毒性肝炎具有良好的治療作用，且其作用均優(yōu)于未修飾的黃芪多糖APS75。
[0009] 有益效果
[0010] 病毒性疾病已經(jīng)成為目前人類和動物健康的最大威脅之一，并造成了巨大的社會 經(jīng)濟(jì)損失。近年來肆虐人類的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、腸道病毒EV71型等等，肆虐 動物的禽流感、新城疫、藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病、細(xì)小病毒病、鴨病毒性肝炎等等， 都使人類和動物生命健康遭受了嚴(yán)重的威脅。病毒性疾病肆虐人畜的一個重要原因是人類 對于這些烈性病毒目前尚沒有臨床特效的藥物。曾今的抗流感病毒特效藥"達(dá)菲"現(xiàn)在對 H5N1、H7N9卻不再那么有效。雖然三氮唑核苷、鹽酸金剛乙胺、無環(huán)鳥苷等抗病毒藥對病毒 病也有一定的臨床療效，但是其引起的惡心、精神素亂、腹與、肝腎功能損傷、眩暈等等不良 反應(yīng)利藥物殘留，這些醫(yī)源性、藥源性疾病的不斷增加使得人們開始拒絕這些抗病毒西藥， 轉(zhuǎn)而選擇毒副作用小的中草藥，目前已有40%以上的消費(fèi)者選擇了中藥或中西結(jié)合治療。 而在養(yǎng)殖業(yè)中，病毒性疾病仍然是目前養(yǎng)禽業(yè)危害最大的疫病之一，隨著金剛燒胺、利巴韋 林等抗病毒西藥的全面被禁用，動物藥品市場上治療動物病毒病的西藥出現(xiàn)了空檔。由于 世界范圍內(nèi)臨床上尚還沒有有效的抗DHV-I藥物，主要通過對種鴨或雛鴨注射弱毒苗進(jìn)行 免疫防御。臨床病例一旦出現(xiàn)3周齡以內(nèi)的感染雛鴨，其病死率往往高于80%，甚至可高達(dá) 100%，造成的損失難以估量。
[0011]黃芪多糖是黃芪的主要藥效成分，具有良好的抗病毒、提高免疫等作用，目前已經(jīng) 開發(fā)成為獸醫(yī)臨床用抗病毒藥物和提高免疫用藥物。廣泛的獸醫(yī)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖 對豬圓環(huán)病毒、繁殖呼吸綜合征病毒、雞傳染性法氏囊病毒等有較好的療效，但對鴨病毒性 肝炎、雞新城疫等瘟疫療效卻不穩(wěn)定。已有的研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖硫酸化分子修飾物具有更 良好的抗病毒作用，但硫酸化分子修飾操作相對復(fù)雜，刺激性大，修飾物水溶性欠佳，生物 利用度也有限。為研制有效的抗鴨病毒性肝炎治療用藥，并提高黃芪多糖的水溶性和生物 利用度，本發(fā)明采用三聚磷酸鈉-三偏磷酸鈉法磷酸化分子修飾黃芪多糖抗鴨病毒性肝炎 有效部位APS 75,所形成的黃芪多糖磷酸酯PAPS75不僅磷酸根和磷酸酯多糖含量高，產(chǎn)物得 率亦很高，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對鴨病毒性肝炎的療效明顯增強(qiáng)，且水溶性良好，制劑使用更為 方便。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下：
[0013] 1.多糖磷酸化分子修飾的方法國內(nèi)雖有3篇報道[1.李益，錢慈，郭明，梁東軍.香 菇多糖磷酸化修飾的工藝研究[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2013，30(5):664-670; 2.孫 雪，潘道東，曾小群，曹錦軒.滸苔多糖的磷酸化修飾工藝[J].食品科學(xué)，2011，32(24): 73-77;3.張難，吳遠(yuǎn)根，莫莉萍，邱樹毅，王文平.香菇多糖磷酸化修飾工藝條件的研究[J].食 品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(12): 63-67]，但此3文并不是對黃芪多糖進(jìn)行修飾，更不是對有效 作用部位進(jìn)行修飾，所選的工藝方法為響應(yīng)面法，本法采用的正交篩選，獲得的最佳修飾條 件也不同。且最根本的在于本發(fā)明所修飾的黃芪多糖為抗鴨病毒性肝炎有效部位APS 75，目 前國內(nèi)外尚未見相似研究。
[0014] 2.通過本發(fā)明實(shí)施所獲得的黃芪多糖磷酸酯PAPS75含量達(dá)36.87%，磷酸根含量為 12.03%，產(chǎn)物得率達(dá)130.32%，而且具有良好的水溶性，入水即溶，制劑使用方便。
[0015] 3.通過本發(fā)明實(shí)施所獲得的黃芪多糖磷酸酯PAPS75不僅對鴨肝炎病毒DHV-I感染 體外培養(yǎng)的鴨胚肝細(xì)胞作用顯著優(yōu)于未修飾黃芪多糖有效部位APS 75,且對DHV-I攻毒感染 鴨的治療作用也優(yōu)于未修飾的黃芪多糖有效部位APS75。 四、【具體實(shí)施方式】
[0016] 1.黃芪多糖的提取及有效部位篩選
[0017] 稱取1000 g黃芪，加10倍量水浸泡3h，加熱煮沸Ih，收集煎煮液，反復(fù)3次;合并收集 的煎煮液，煮沸濃縮至1000 mL，用高速離心機(jī)離心，取上清。緩慢向濃縮液中加入不同體積 分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，使溶液中乙醇含量分別為50%、65%、75 %、80%，靜置過夜，分別離心 收集沉淀。經(jīng)流水透析后，真空濃縮，3000rpm/min，離心20min，上清再次加入不同體積分?jǐn)?shù) 95%乙醇沉淀，重復(fù)透析、濃縮、離心，反復(fù)3次后，60°C真空干燥，碾碎，分別得到黃芪多糖 不同醇沉部位六?3 5()^?365^?375^?38()和總多糖六?3*。
[0018] 3日齡非免櫻桃谷鴨隨機(jī)均分7組，每組31羽，分別為空白對照組、攻毒對照組和5 個不同醇沉部位黃芪多糖組。除空白對照組外，其余6組鴨分別肌肉注射鴨肝炎病毒DHV-I 0.2mL/羽后，Ih后各多糖組分別于飲水中添加多糖飲喂，5mg/羽.天，連續(xù)3天，每天觀察記 錄各組鴨死亡情況，死亡鴨及時逐只剖檢觀察病變，剔除無病變雛鴨，待全群鴨停止死亡 時，統(tǒng)計(jì)各組存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖不同醇沉部位APS 5q、APS65、APS75、APS8q和總多糖 APSt及攻毒對照組各組存活率依次為12.90 %、16.13 %、22.58 %、19.35 %、19.35 %和 16.13%。其中75%醇沉部位APS75的存活率顯著高于攻毒對照組，并高于其他醇沉部位，擬 對此部位進(jìn)一步修飾研究。
[0019] 2.黃芪多糖有效部位APS75磷酸化分子修飾及條件優(yōu)化
[0020]采用三聚磷酸鈉-三偏磷酸鈉法磷酸化分子修飾黃芪多糖有效部位APS75。根據(jù)單 因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，反應(yīng)PH值、反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間對磷酸化修飾的影響較大，采用正交試驗(yàn) 設(shè)計(jì)方法，選取反應(yīng)PH值(A)、反應(yīng)溫度(B)和反應(yīng)時間（C)為因素，確定三個水平，按照正交 表L 9(34)(表1)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。
[0021]表1正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)
[0024] 精確稱取2.5000g三聚磷酸鈉和I .OOOOg三偏磷酸鈉，溶于50ml蒸餾水中；精密稱 取250mg黃芪多糖有效部位APS75加入至100mL蒸餾水中，充分溶解后將配好的三聚磷酸鈉-三偏磷酸鈉混合液50ml加入，調(diào)節(jié)pH = 7.5~9，置恒溫水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)溫度70 °C~90 °C、反 應(yīng)時間4~8h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物先用自來水透析48h，再用蒸餾水透析24h，冷凍干燥后 得磷酸化黃芪多糖。結(jié)果見表2。
[0025] 表2L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果
[0027]以產(chǎn)物量為指標(biāo)，最佳組合為A2B3C1，產(chǎn)物量為336.8mg，以產(chǎn)物量為指