一種針對脂肪酸結(jié)合蛋白受體的腦膠質(zhì)瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及靶向藥物遞送系統(tǒng)，具體涉及一種針對脂肪酸結(jié)合蛋白受體的腦膠質(zhì)瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)。該靶向藥物遞送系統(tǒng)包括將生物材料制成納米制劑，并通過在其表面化學(xué)鍵合靶向功能性多肽分子，將包載于載體中的抗腫瘤藥物特異性遞送至腫瘤部位。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)資料顯示，腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，約占所有原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的80% ;該疾患惡性程度高，臨床治療效果不理想且預(yù)后差。目前臨床對于腦膠質(zhì)瘤的主要治療手段為手術(shù)切除，但因腦膠質(zhì)瘤惡性程度高，呈浸潤性生長，與正常組織無明顯分界，且腫瘤多位于重要功能區(qū)，如中央溝區(qū)、丘腦、基底節(jié)、腦干等部位，因此給通過手術(shù)完全切除提出了重大的挑戰(zhàn)。鑒于紫杉醇、阿霉素等藥物對腫瘤細(xì)胞有較好的毒性作用，化學(xué)療法亦成為了臨床上治療腫瘤的常用手段之一。然而，治療實(shí)踐顯示，大部分的化療藥物難以進(jìn)入腫瘤部位，從而大大降低了治療效果。此外，化療過程中許多化療藥物能夠被正常組織細(xì)胞攝入，因此在治療的同時(shí)常給患者帶來脫發(fā)等重大的副作用。由此可見，對于腦膠質(zhì)瘤的治療，急需探尋一種安全有效的藥物遞送方式，使其不僅能夠準(zhǔn)確的將化療藥物遞送至腫瘤部位，同時(shí)還能夠大大降低藥物在正常組織中的聚集。
[0003]有研究表明，對于腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種實(shí)體瘤而言，在其生長和轉(zhuǎn)移過程中均會有大量的新生血管形成，而腦膠質(zhì)瘤是新生血管分布最多的腫瘤之一。有研究針對腦膠質(zhì)瘤中的新生血管設(shè)計(jì)了多種不同的遞藥系統(tǒng)，并獲得了較好的治療效果，其原因于，與直接靶向腫瘤細(xì)胞遞藥相比，靶向腫瘤新生血管有其所不具備的優(yōu)點(diǎn):其一，將遞藥系統(tǒng)靜脈注射入體內(nèi)后，經(jīng)血液循環(huán)最先與新生血管中的內(nèi)皮細(xì)胞接觸；其二，腫瘤新生血管與正常組織部位血管相比有更強(qiáng)的滲透率和滯留效應(yīng)，利于遞藥系統(tǒng)通過被動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入腫瘤；其三，腫瘤內(nèi)部具有較大的細(xì)胞密度以及較高的間質(zhì)液壓，對遞藥系統(tǒng)在其內(nèi)部的轉(zhuǎn)運(yùn)有很大的阻礙作用，而靶向新生血管能夠規(guī)避這方面的障礙。然而，靶向腫瘤新生血管雖然能夠有效破壞腫瘤血管的結(jié)構(gòu)從而影響腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，但并不能夠有效殺滅腫瘤細(xì)胞，易引起腫瘤的復(fù)發(fā)。還有研究顯示，單純的拮抗腫瘤新生血管也會促使轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。因此，要獲得理想的抗腫瘤效果，需在靶向破壞腫瘤新生血管的同時(shí)，能夠特異性的針對腫瘤細(xì)胞遞送化療藥物，以達(dá)到雙級靶向遞藥的目的。
[0004]MDGI為脂肪酸結(jié)合蛋白家族中的一種小分子蛋白，主要存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，對細(xì)胞的增殖和分化有重要的影響作用。研究顯示，MDGI在多種腫瘤的發(fā)生機(jī)制中起到關(guān)鍵的作用，已有相關(guān)報(bào)道表明，MDGI在包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞以及腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有大量表達(dá)。此外，在正常的心、肺、乳腺和腦等組織中也有MDGI蛋白的存在，但該蛋白不在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。
[0005]本申請的發(fā)明人擬提供一種靶向腫瘤遞送抗癌藥物，尤其是針對脂肪酸結(jié)合蛋白受體的腦膠質(zhì)瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)，通過在其表面化學(xué)鍵合靶向功能性多肽分子，將包載于載體中的抗腫瘤藥物特異性遞送至腫瘤部位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種靶向腫瘤遞送抗癌藥物，尤其是針對脂肪酸結(jié)合蛋白受體的腦膠質(zhì)瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)，本發(fā)明以高性能生物材料制成的納米粒為載體，包載廣譜性抗腫瘤藥物紫杉醇，最后在載體表面加以修飾功能性多肽，利用多肽的腫瘤細(xì)胞和新生血管靶向的特性，達(dá)到靶向腫瘤遞送抗癌藥物的目的。
[0007]本發(fā)明是一種以在多種腫瘤組織中廣泛表達(dá)的脂肪酸結(jié)合蛋白家族中的乳腺衍生生長抑制劑(MDGI/H-FABP/FABP3)為受體的靶向遞藥系統(tǒng)，采用雙親性材料構(gòu)建的納米粒(NP)為藥物載體，通過官能團(tuán)之間的化學(xué)鍵合，將功能性分子多肽連接在載體表面，構(gòu)建成具有腫瘤靶向遞藥功能的藥物遞送系統(tǒng)。
[0008]本發(fā)明采用高分子材料制成納米載藥系統(tǒng)，將COOP肽作為靶向分子，通過多肽中的巰基與載體表面的馬來酰亞胺基之間的共價(jià)連接，制備成能夠同時(shí)靶向腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和新生血管的遞藥系統(tǒng)。
[0009]本發(fā)明中的COOP為一種采用噬菌體展示技術(shù)得到的短序列多肽分子，能夠特異性地與細(xì)胞中的MDGI受體結(jié)合；雖然MDGI受體在正常組織中有表達(dá)，但研究表明，由于MDGI受體在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中沒有表達(dá)以及正常血管內(nèi)皮細(xì)胞間致密的特點(diǎn)，因此，COOP多肽修飾的遞藥系統(tǒng)不能通過正常血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入正常組織部位。
[0010]更具體的，本發(fā)明的針對脂肪酸結(jié)合蛋白受體的腦膠質(zhì)瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)，以FDA批準(zhǔn)的材料聚乳酸構(gòu)建成生物可降解、相容性好以及載藥量高的藥物載體；所述載體通過共價(jià)連接的方式與具靶向功能的多肽分子相連，達(dá)到靶向腫瘤遞藥的目的；
[0011]本發(fā)明中，采用抗微管藥物紫杉醇為模型藥物，并通過物理包載的方式包載于所述遞藥系統(tǒng)內(nèi)。
[0012]本發(fā)明以在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有高表達(dá)量的脂肪酸結(jié)合蛋白為受體，以對該受體具有高親和性的COOP肽為靶向功能分子。
[0013]本發(fā)明所采用的人源母膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為均為本領(lǐng)域所熟知且可市購獲得。
[0014]本發(fā)明提供的靶向遞藥系統(tǒng)能夠包載多種化療藥物，如紫杉醇、阿霉素以及長春新喊等。
[0015]本發(fā)明中，構(gòu)建藥物載體的材料聚乳酸為聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物；所述的嵌段共聚物包括馬來酰亞胺基聚乙二醇聚乳酸(MAL-PEG-PLA)，其分子量為20000-40000Da ;單甲氧基聚乙二醇聚乳酸(MPEG-PLA)，其分子量為20000_40000Da。
[0016]本發(fā)明中，具有靶向功能的多肽分子為一種以脂肪酸結(jié)合蛋白為靶向受體的多肽，其名稱為coop，完整序列為:nh2-cglsglgva。
[0017]本發(fā)明提供了所述的針對脂肪酸結(jié)合蛋白受體的腦膠質(zhì)瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)的制備方法，其包括步驟:
[0018](I)制備載藥納米粒
[0019]用二氯甲烷溶解MPEG-PLA和MAL-PEG-PLA混合物，加入紫杉醇(PTX)使其濃度為0.5mg/mL,加入I %的膽酸鈉溶液；冰水浴沖超聲2.4min (間隔時(shí)間2s，功率為240W)，
0.5%膽酸鈉溶液分散5min ;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷后，在4°C條件下，離心lh，得普通載藥納米粒(PTX-NPs)；
[0020](2)連接COOP多肽與納米載體
[0021]將上述所得納米粒用0.01MHEPES (4_羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液重懸，取COOP肽溶液，按多肽分子中的巰基和納米粒表面的馬來酰亞胺基摩爾比1:1加入，反應(yīng)6h后，離心，去上清液，得所需制劑。
[0022]本發(fā)明中，聚乙二醇的引入能夠使遞藥系統(tǒng)躲避體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮吸附系統(tǒng)的吸附以及巨噬細(xì)胞的吞噬，從而能夠延長載藥系統(tǒng)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，有利于其通過被動和主動兩種方式進(jìn)入腫瘤組織。
[0023]本發(fā)明所制備的靶向遞藥系統(tǒng)除適用于本文中的腦膠質(zhì)瘤外，同時(shí)還適用于直腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等多種實(shí)體瘤。
[0024]本發(fā)明通過細(xì)胞特異性攝取，抗細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)以及荷瘤小鼠體內(nèi)靶向性考察等實(shí)驗(yàn)，表明該遞藥系統(tǒng)對腦膠質(zhì)瘤具有較強(qiáng)的特異性靶向作用，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該靶向遞藥系統(tǒng)能夠明顯延長荷瘤動物的生存期；活體成像技術(shù)以及免疫熒光也顯示，該遞藥系統(tǒng)具有良好的體內(nèi)腫瘤靶向性和腫瘤實(shí)質(zhì)的穿透作用。
【附圖說明】
[0025]圖1是HUVEC細(xì)胞對載香豆素納米粒攝取的定性和定量結(jié)果，其中，
[0026]圖A是HUVEC細(xì)胞對NP和COOP-NP的定性攝取圖片，圖B為定量結(jié)果。
[0027]圖2是U87細(xì)胞對載香豆素納米粒攝取的定性和定量結(jié)果，其中，
[0028]圖A是U87細(xì)胞對NP和COOP-NP的定性攝取圖片，圖B為定量結(jié)果。
[0029]圖3是載紫杉醇納米制劑對U87和HUVEC兩種細(xì)胞的毒性結(jié)果，其中，
[0030]圖A是HUVEC細(xì)胞經(jīng)不同PTX制劑處理后的細(xì)胞存活率；圖B是U87細(xì)胞經(jīng)不同PTX制劑處理后的細(xì)胞存活率。
[0031]圖4是采用活體成像技術(shù)所拍攝的載DIR納米粒的組織分布圖，其中，
[0032]圖A、B分別為NP及COOP-NP在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布圖。
[0033]圖5是載紫杉醇靶向遞藥系統(tǒng)對荷瘤動物的藥效學(xué)評價(jià)及載香豆素納米粒在腫瘤中的分布圖，其中，
[0034]圖A為給以不同PTX制劑后的各組小鼠生存期；圖B為荷原位腦膠質(zhì)瘤小鼠腦部切片的免疫熒光圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]實(shí)施例1制備藥物遞送系統(tǒng)
[0036](I)制備載藥納米粒
[0037]用ImL 二氯甲烷溶解 22.5mg 的 MPEG-PLA 和 2.5mg 的 MAL-PEG-PLA 混合物，并加入紫杉醇(PTX)使其濃度為0.5mg/mL，隨后加入2mLl%的膽酸鈉溶液；冰水浴沖超聲
2.4min(間隔時(shí)間2s，功率為240W)，1mL0.5%膽酸鈉溶液分散5min。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷后，在4°C條件下，14500rpm離心lh，即得普通載藥納米粒(PTX-NPs)；
[0038](2)連接COOP多肽與納米載體
[0039]將上述所得納米粒用0.01MHEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液重懸，取COOP肽溶液，按多肽分子中的巰基和納