二甲基補(bǔ)骨脂素在制備抗多藥耐藥性腫瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬制藥技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及二甲基補(bǔ)骨脂素(DMFC)的新用途，即DMFC在制備抗 多藥耐藥性腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤化療是治療腫瘤的一種基本手段，但腫瘤化療的效果會(huì)因?yàn)槟[瘤細(xì)胞獲得抗 藥性而失敗，多藥耐藥(multiple化ug resis1:ance，MDR)指腫瘤細(xì)胞對(duì)不同結(jié)構(gòu)和作用機(jī) 理的多種藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，是化療失敗的主要原因。MDR的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，其中一個(gè)原 因與細(xì)胞調(diào)亡過程有關(guān)，文獻(xiàn)指出，促調(diào)亡蛋白Bim和抗調(diào)亡蛋白Bcl-2在腫瘤細(xì)胞調(diào)亡過 程中發(fā)揮重要作用，所WBim表達(dá)量的減少或者Bd-2表達(dá)量增加均會(huì)導(dǎo)致某些腫瘤細(xì)胞產(chǎn) 生多藥耐藥性。
[0003] 目前臨床上使用的抗癌藥物，阿霉素，表阿霉素，絲裂霉素，柔紅霉素，紫杉醇，長(zhǎng) 春新堿，順銷等，均為耐藥腫瘤細(xì)胞所抗。腫瘤細(xì)胞獲得的抗藥性，并不針對(duì)一種抗癌藥，而 是對(duì)多種抗癌藥，即多藥耐藥，要增加多藥耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，辦法之一就是促 進(jìn)/抑制Bim/Bcl-2蛋白的功能，增加其蛋白表達(dá)量的比例，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡，因此 研制促進(jìn)/抑制運(yùn)些蛋白功能的藥物對(duì)腫瘤的化療有重要意義。
[0004] 本發(fā)明所述DMFC是香豆素 (coumarin)衍生物，由多種化合物進(jìn)行多步反應(yīng)修飾后 得到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種二甲基補(bǔ)骨脂素在制備抗多藥耐藥性腫瘤藥物中的應(yīng) 用，具體是制備抗多藥耐藥性肝癌藥物中的應(yīng)用，是DMFC的一種新的用途，所述的二甲基補(bǔ) 骨脂素(DMFC)是經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)修飾所得的香豆素衍生物，分子式為Ci3Hi〇〇3,分子量214。 所述藥物由DMFC與制劑允許的藥物賦形劑或載體組成。DMFC的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0006]
[0007]本發(fā)明提供的藥物，其制劑形式為液體制劑、固體制劑，主要包括顆粒劑、片劑、沖 劑、軟膠丸、軟膠囊、滴丸劑或注射劑。
[000引本發(fā)明提供的藥物，制劑的給藥形式主要包括口服給藥或注射給藥。
[0009] DMFC對(duì)多藥耐藥肝癌細(xì)胞R-HepG2(RD)的殺傷作用明顯優(yōu)于紫杉醇，阿霉素，順銷 等臨床常用藥，DMFC殺死多藥耐藥肝癌細(xì)胞的機(jī)理是促進(jìn)促調(diào)亡蛋白Bim的增加并抑制抗 調(diào)亡蛋白Bcl-2從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞調(diào)亡，目前臨床上缺乏能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性腫瘤的藥物，因 此DMFC具有很好的制備抗多藥耐藥性腫瘤藥物的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0010] 圖1:不同濃度DMF巧審制R-H邱G2(畑)體外增殖比較。
[0011 ] 圖2:DMFC誘導(dǎo)畑細(xì)胞調(diào)亡的Annexin V-PI雙染調(diào)亡比較圖。
[001^ 圖3:01。(：誘導(dǎo)畑細(xì)胞PARP蛋白剪切比較圖。
[0013] 圖4: DMFC誘導(dǎo)畑細(xì)胞caspase蛋白剪切比較圖。
[0014] 圖5: DMFC促進(jìn)/抑制Bim/Bcl-2表達(dá)比較圖。
[001引圖6:DMFC促進(jìn)Bax活化的免疫印跡比較圖。
[0016] 圖7:DMFC促進(jìn)Bim從Mcl-l中替換Bak結(jié)果圖。
[0017]圖8:DMFC促進(jìn)Bak活化的流式細(xì)胞檢測(cè)比較圖。
[001引圖9:DMFC誘導(dǎo)畑細(xì)胞線粒體膜電位變化的JC-1染色比較圖。
[0019] 圖10 :DMFC誘導(dǎo)畑細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素 C釋放比較圖。
[0020] 圖11 :DMF巧審制小鼠模型實(shí)體瘤效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] W下將結(jié)合具體實(shí)施例與附圖詳細(xì)說明本發(fā)明，運(yùn)些實(shí)例僅用于說明目的，而不 用于限制本發(fā)明范圍。
[0022] 實(shí)施例一:DMFC化合物的獲得 [002引實(shí)驗(yàn)方法
[0024] 1.合成：將20ml間二苯酪(70mM)和乙酷乙酸乙醋（70mM)的混合溶液在0°C逐滴加 入120ml的出S化(12M)溶液中，恢復(fù)室溫后攬拌12h。然后混合液倒入100ml冰水中，過濾收集 固體后再用冰水洗涂一次。再在甲醇中重結(jié)晶得到純白色7-徑基-4-甲基香豆素（11.12g， 90%)。室溫下，逐滴把將溶解于75ml丙酬和75ml二氯甲燒的K2C〇3(62mM)和氯丙酬(45mM， 4.16g)加入上述7-徑基-4-甲基香豆素(31mM，5.46g)中并用力攬拌。加入完成后，用薄層色 譜法回流4她后冷卻過濾，濾液減壓蒸發(fā)后獲得的殘?jiān)诩状贾兄亟Y(jié)晶得到5.61g白色固 體。在氮?dú)猸h(huán)境中，將上述固體5.3：3g溶解在140mWa0H( 1M)中回流2地，冷卻后用2M的HC1處 理。得到的沉淀用冰水洗涂后在甲醇中重結(jié)晶即得到固體DMFC(4.04g)。
[00巧]2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:DMFC，分子式為打抽1〇〇3,所得DMFC的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
[0026]
[0027] 實(shí)施例二肝癌多藥耐藥細(xì)胞RD對(duì)臨床抗腫瘤藥的敏感性實(shí)驗(yàn)
[0028] 材料和方法：
[0029] 阿霉素 J頓銷，紫杉醇，MTT均購自Sigma公司，Bel-2蛋白抗體購自Santa Cruz， Bim，細(xì)胞色素 C等蛋白抗體購自CSTdDMFC溶解在PBS中配成lOmg/ml母液，置于-20°C冰箱， 實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度供用。
[0030] 肝癌細(xì)胞Η邱G2購自美國(guó)American Type Qilture Collection,耐藥細(xì)胞R-H邱G2 (RD)的建立，系由化pG巧日抗癌藥物阿霉素培養(yǎng)，存活下來的細(xì)胞繼續(xù)添加較高濃度的阿霉 素繼代培養(yǎng)，不斷培養(yǎng)一段時(shí)間后，挑選抗藥性克隆建系即R-HepG2。
[0031 ] 細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基（Invitrogene)，添加 5%小牛血清（Invitrogene)，2mM谷 氨酷胺，37 °C，10 % C〇2培養(yǎng)箱。
[0032] 四甲基偶氮挫鹽(簡(jiǎn)稱MTT法)檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響:選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì)胞，X 1〇4的密度接種于96孔板中，置37°C，10%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后加入不同濃度 的藥物，每個(gè)濃度設(shè)復(fù)孔6個(gè)，培養(yǎng)48小時(shí)，吸出孔板中培養(yǎng)液，往每孔中加入濃度為Img/ml 的MTT5化1，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，取出加過MTT的96孔板，每孔加入15化1的DMS0， 輕輕震蕩孔板lOmin，待孔底部的結(jié)晶物完全溶解后，將孔板放入酶標(biāo)儀中測(cè)波長(zhǎng)在570nm 的各孔的光吸收值，記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)Ξ次，用IC50軟件計(jì)算半數(shù)增殖抑制濃度IC50。
[0033] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和附圖1。
[0034] 表1為不同濃度的臨床抗腫瘤藥阿霉素，順銷和紫杉醇分別作用于RD，其半數(shù)增殖 抑制濃度IC50的比較。由表中可見，RD對(duì)Ξ種抗腫瘤藥的作用，均表現(xiàn)出比DMFC更高的耐藥 性。說明RD是來自化pG2的多藥耐藥細(xì)胞株，且對(duì)多種抗癌藥物有耐受性，尤其抗阿霉素。
[0035] 圖1中表示不同濃度DMFC處理RD細(xì)胞后細(xì)胞的存活情況，DMFC對(duì)RD的半數(shù)增殖抑 制濃度經(jīng)計(jì)算為25.02μΜ。
[0036] 表1.RD對(duì)抗腫瘤藥的敏感性
[0037]
[00；3 引
[0039] 實(shí)施例SDMFC對(duì)RD的體外增殖抑制機(jī)制
[0040] AnnexinV-PI雙染實(shí)驗(yàn)：約3χ105個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌RD細(xì)胞與DMFC共同解育 4化，，膜酶消化收集細(xì)胞，PBS清洗一次，加入50化1的Annexin V-門TC結(jié)合緩沖液，含25μ1 的AnnexinV-FITC和5μ1的PI緩沖液，然后避光解育15min，用FACSCanto流式細(xì)胞儀 (Becton Dickinson)分析結(jié)果。
[0041 ] Western blot實(shí)驗(yàn)：3 X106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的畑細(xì)胞與DMFC共同解育4她，用RIPA裂 解液裂解，14，OOOxg離屯、7min后，用化a壯ord測(cè)定蛋白濃度，在12 % SDS-PAGE膠上進(jìn)行電 泳，膠上的斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后與抗體在室溫下解育，清洗后再與二抗共同解育。最 后用E化試劑盒(Amersham)進(jìn)行顯色觀察。
[0042] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖2、圖3和圖4。
[0043] 細(xì)胞調(diào)亡早期，細(xì)胞膜上的憐脂酷絲氨酸（PS)會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外， AnnexinV可與其結(jié)合，而調(diào)亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然保持完整，染料PI不能進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行染 色，因此通過AnnexinV-PI雙染實(shí)驗(yàn)，可區(qū)分調(diào)亡與壞死細(xì)胞。細(xì)胞調(diào)亡最典型的特征之 一，是細(xì)胞在接受藥物作用后，多聚ADP核糖聚合酶(PARP)會(huì)發(fā)生剪切，而負(fù)責(zé)細(xì)胞調(diào)亡過 程中重要作用的半脫氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶(Caspase)也有剪切發(fā)生。附圖2,表 示畑細(xì)胞的AnnexinV-PI圖，從左至右每一小圖分別代表DMFC濃度0、20μΜ、40μΜ和80μΜ處 理，可W看出DMFC可誘導(dǎo)畑調(diào)亡，且畑的調(diào)亡程度隨著DMFC的濃度增加而增力日，在四個(gè)濃度 下的調(diào)亡率分別是6.55%，9.15%，11.90%和24.26%。附圖3表示PARP剪切的圖中，DMFC處 理后通過western blot檢測(cè)到剪切后的PARP(cleaved PARP)隨著DMFC藥物濃度的增加而 增加。附圖4中可W看到經(jīng)過DMFC處理的RD細(xì)胞內(nèi)，caspase3，7，8，9蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯 著變化，而其活性形式的剪切caspase(cleaved caspase3,7,8,9)有了顯著的增加。
[0044] 實(shí)施例Ξ表明，DMF巧Φ制畑體外增殖是通過誘導(dǎo)畑產(chǎn)生調(diào)亡。
[0045] 實(shí)施例四DMFC誘導(dǎo)畑細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)亡的途徑
[0046] 實(shí)驗(yàn)材料和方法:實(shí)驗(yàn)材料同實(shí)施例二
[0047] 方法 1，weste;rn blot同實(shí)施例Ξ
[004引方法2，RD細(xì)胞中Bim和Bcl-2轉(zhuǎn)錄水平變化