含有白介素15的防治hpv感染的疫苗噴霧劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種防治HPV感染的疫苗噴霧劑組方，所述組方包括HPV病毒顆粒及 細(xì)胞因子如白介素15,屬于生物制藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳頭瘤病毒是小DNA腫瘤病毒，具有高度物種轉(zhuǎn)移性。迄今為止，有記載的個體人 乳頭瘤病毒（HPV)基因已超過100種。HPV通?；?qū)ζつw專一（例如HPV-I和HPV-2)，或 者對黏膜表面專一，而且一般會引起持續(xù)數(shù)月或數(shù)年的良性腫瘤。此類良性腫瘤可能引起 患者的不安，但除了少數(shù)例外情況，并不會對生命造成威脅。
[0003] 在HPV引起的人類疾病中，婦女宮頸的HPV感染最為常見，危害性也最大，HPV是 慢性宮頸炎的主要病原。在宮頸粘膜柱狀上皮和鱗狀上皮轉(zhuǎn)變的區(qū)帶處，是嗜粘膜型乳頭 瘤病毒繁殖的部位，也是慢性宮頸炎的好發(fā)部位。慢性宮頸炎的病因復(fù)雜，1989年中國病毒 基因工程國家重點實驗室和北京天壇醫(yī)院合作研究發(fā)現(xiàn)，慢性宮頸炎患者宮頸中HPV的檢 出率均明顯高于正常宮頸。HPV16感染與慢性宮頸炎關(guān)系更為密切，我國的研究發(fā)現(xiàn)，慢性 宮頸炎患者的宮頸組織和洗液中，HPV16的檢出率可高達(dá)20% -50%。
[0004] 一些HPV還與癌癥有關(guān)，被稱為至癌HPV型。HPV-16和HPV-18與宮頸癌之間存 在的關(guān)聯(lián)是HPV與人類癌癥間最為肯定的關(guān)聯(lián)。在發(fā)展中國家，宮頸癌是最為普遍的惡性 腫瘤，嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生活質(zhì)量。其發(fā)生發(fā)展已呈現(xiàn)年輕化的趨勢，由于地區(qū)間的 不同宮勁癌發(fā)病有河大差異，我國約占世界1/3。引起宮頸癌的HPV型別較多，近年來研究 鑒定了 30個型別的HPV與宮頸癌有關(guān)，與癌癥有特殊關(guān)聯(lián)的其它HPV型分別有31、33、35、 39、45、51、52、56、58、59、66和68型。其中16、18、45、31型別占全球?qū)m頸癌病因的80%， 宮頸癌是世界上婦女僅次于乳腺癌的第二位最常見的癌癥，是全球婦女癌癥死亡率的第= 位，全球每年約有50萬新宮頸癌病例，每年約有27萬婦女死于此病。 陽0化]此外，HPV也可能在某些頭頸部的癌瘤W及更致命的黑素瘤和其它癌癥中起作用 (參見例如，Mellin. et al, Internat. J. Cancer, 2000, 89:300 ;Zumbach, et al. Internat J. Cancer, 2000, 85:815 !Drear, et al. Annals Su;rgery. 2000, 231:664)。
[0006] 目前晚期宮頸癌的治療尚無良策，早期宮頸癌及癌前病變的治療多采用藥物腐 蝕、激光冷凍及宮頸錐形切除，不能防止乳頭瘤病毒再感染的可能性，且技術(shù)條件要求相對 較高，不適合落后地區(qū)推廣應(yīng)用，而對無癥狀的慢性持續(xù)性感染則無對策。
[0007] 2006年6月，美國抑A批準(zhǔn)了 Merck公司開發(fā)生產(chǎn)的4價化，11，16和18型）HPV 疫苗GARDASIL篡，不僅是人類第一個特異性預(yù)防癌癥的疫苗，也是第一個不僅預(yù)防宮頸 癌，也預(yù)防性性痛的疫苗，可W預(yù)防有HPV6、11、16和18引起的感染，預(yù)防宮頸癌和性痛，批 準(zhǔn)用于9-26歲的女性。
[0008] 已有人提出，HPV的病毒樣顆粒（VLP)有可能成為治療HPV的疫苗，動物研究表 明，VLP對其它HPV型感染不產(chǎn)生交叉保護作用，參見例如Suzich, J.A.等，Proc化tl Acad Sci, 92:11553-11557, 1995 ;和 Brei憂urd, Seminars in Cancer Biology,第 9 卷，第 431-445 頁，1999。
[0009] 申請?zhí)枮?00380109729. 2的中國專利公布了 HPV-16和HPV-18L1VLP的疫苗，包 含HPV16的VLP和HPV18的VLP的組合物在制備用于預(yù)防有一組致癌HPV型中的一種或多 種HPV型引起的感染和/或疾病藥物中的用途，運種疫苗是HPV的VLP和佐劑聯(lián)合應(yīng)用，佐 劑是侶鹽和3D-MPL的組合，正在運篇專利申請中還提到了運種包含HPV16和HPV18的VLP 的混合物在預(yù)防由 HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、 HPV66和HPV68引起的感染性疾病的發(fā)生，通式在該專利中還提到了運種疫苗可W通過口 月良、局部、皮下、黏膜（陰道內(nèi)）、靜脈、肌肉、鼻下、舌下、真皮及通過栓劑供給。
[0010] 2006年10月的《國際腫瘤學(xué)雜志》公布了題為"人乳頭瘤病毒疫苗臨床試驗進 展"，文中提到了治療HPV感染的疫苗，運類疫苗包括多膚疫苗，病毒載體疫苗W及DNA疫 苗，結(jié)果表明用HPV16E43-77的35個氨基酸長的膚制成的多膚疫苗具有治療HPV病毒感染 的效果，同樣HPV16和HPV18的E6和E7蛋白重組痘苗病毒載體疫苗也可W治療HPV病毒 的感染。
[0011] 中國專利CN200710188168.X公開了防治人乳頭瘤病毒感染的復(fù)方疫苗組合物， 在所述的疫苗組合物物中，在HPV16和HPV18病毒顆粒組合物基礎(chǔ)上，輔W人干擾素等細(xì)胞 因子，既可預(yù)防宮頸癌又可治療HPV感染，包括慢性宮頸炎、宮頸上皮發(fā)育不良，防治兩用， 而且適用于任何年齡的已婚婦女，可W反復(fù)使用。組合物中，除人干擾素細(xì)胞因子外，還包 括人白介素2、人白介素12、胸腺素0 W及乳鐵蛋白細(xì)胞因子。 陽〇1引發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明基于在中國專利CN200710188168.X的基礎(chǔ)上，提供了一種改良的防治人 乳頭瘤病毒感染的復(fù)方疫苗組合物，研究人員發(fā)現(xiàn)，W白介素15替代CN200710188168. X中 的IL-2及IL12,用于HPV病毒感染的疾病防治時，具有更佳的免疫效果，表現(xiàn)在可W獲得更 高的IgG、SlgA抗體水平；細(xì)胞免疫檢測時，也可W檢測到更高的IFN-丫水平。
[0014] 具體地，本發(fā)明的目的在于提供一種新的包括HPV16的VLP和HPV18的VLP的疫 苗組合物，在此基礎(chǔ)上，輔W人白介素15 W及帶正電荷的多糖殼聚糖，所述組合物即可預(yù) 防宮頸癌又可治療HPV感染，包括慢性宮頸炎、宮頸上皮發(fā)育不良等，不僅對HPV16和18感 染有預(yù)防作用，對其它型別HPV感染也有一定的交叉保護作用，還可W產(chǎn)生系統(tǒng)免疫W及 局部黏膜免疫，制成噴霧劑后可用于陰道噴霧，使用方便。
[0015] 粘膜免疫系統(tǒng)是機體整個免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，也是具有獨特結(jié)構(gòu)和功能的 獨立免疫體系，它在抵抗感染方面起著極其重要的作用。粘膜表面是人體與外界抗原直接 接觸，是機體抵抗感染的第一道重要防線。除注射免疫所誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫之外， 粘膜免疫最主要的功能是誘導(dǎo)局部免疫。實驗證明：通過粘膜免疫后，粘膜局部的抗體比血 清抗體出現(xiàn)得早、效價高，且維持的時間長。
[0016] 分泌型IgA(SlgA)是粘膜應(yīng)答過程中的主要效應(yīng)因子，SlgA的粘膜親和性與抵抗 蛋白酶的作用，均有助于其對病毒、細(xì)菌的親和作用。由于外分泌液中SlgA含量多，又不容 易被蛋白酶破壞，故成為抗感染、抗過敏的一道主要屏障。研究結(jié)果顯示，在粘膜的某處受 到抗原刺激的粘膜活性細(xì)胞，尤其是在腸道或鼻腔內(nèi)粘膜的刺激，會在機體的其他粘膜部 位，例如肺產(chǎn)生相應(yīng)的特異性免疫反應(yīng)。也就是通過口服或滴鼻接種疫苗，可W使機體全部 的粘膜獲得抵御相應(yīng)傳染病的免疫保護力。
[0017] 雖然從粘膜途徑接種疫苗產(chǎn)生的主要是局部免疫反應(yīng)，但是實驗結(jié)果顯示粘膜免 疫也能產(chǎn)生很高的血清抗體效價，也能誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋己細(xì)胞的活性。
[0018] 進一步地，本發(fā)明用于防治HPV感染的疫苗噴霧劑，所述疫苗噴霧劑，W每毫升量 計算，包括：防治有效量的滅活病原體，所述滅活病原體為HPV-16的Ll蛋白病毒樣顆粒和 /或HPV-18的Ll蛋白的病毒樣顆粒；5-50萬單位的人白介素15 ; I-IOmg的殼聚糖；W及 用于調(diào)節(jié)抑至4. 0~6. 0范圍內(nèi)的憐酸鹽緩沖液。
[0019] 所述的防治有效量的滅活病原體，是指防治有效量的滅活HPV病毒，如HPV-16的 Ll蛋白病毒樣顆粒和/或HPV-18的Ll蛋白病毒樣顆粒，防治有效量的范圍，是指能對感 染了 HPV病毒的患者，于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)中HPV滅活病原體在HPV 感染中的運用，是容易確定的，本發(fā)明中，優(yōu)選的用量是每毫升噴霧劑中包括40-120mg的 HPV-16L1蛋白病毒樣顆粒和/或40-120mg的HPV-18L1蛋白病毒樣顆粒。
[0020] 其中，HPV-16和HPV-18蛋白為Ll全長基因按酵母的密碼偏嗜性改造后在酵母中 表達(dá)并純化，運種改造可W用生物學(xué)軟件Vector NTI 10對HPV16、18的密碼子進行全基 因改造，Ll蛋白形成病毒樣顆粒（VLP)，形成完整的空間構(gòu)想，保持其抗原性。HPV-16和 HPV-18的Ll蛋白的VLP制備已經(jīng)為現(xiàn)有技術(shù)，具體參見專利W09913056. HPV-16和HPV-18 的LI蛋白的VLP可引起較好的免疫反應(yīng)。
[0021] 白細(xì)胞介素15 (比-15)是Gr油stein等人于1994年發(fā)現(xiàn)的一種約為12-14kD的 細(xì)胞因子，天然人白介素15成熟膚含有114個氨基酸。與大多數(shù)細(xì)胞因子相似，比-15可 在機體正常的免疫