917;Bu;rton，D.R.，et al.，Nature288(1980)338-344;Thommesen，J.E.，et al.，Mol.Immunol.37(2000)995-1004;Idusogie，E.E.，et al.， J.Immunol.l64(2000)4178-4184;Hezareh，M.，etal.，J.Virology75(2001)12161-12168;Morgan，A.，et al.，Immunology86(1995)319-324;EP 0 307 434。此類結(jié)合位點(diǎn)是 例如 1^2：34，1^235,0270，肥97,6318，1(320，1(322，？33巧日？329(編號(hào)依照1(曰6曰1，6.4.的抓索引， 見(jiàn)下文）。亞類IgGl，IgG2和IgG3的抗體通常顯示補(bǔ)體活化和Clq和C3結(jié)合，而IgG4不活化補(bǔ) 體系統(tǒng)且不結(jié)合Clq和C3。
[0136] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述抗體是人IgG類的（即IgGl，IgG2，IgG3或IgG4亞類 的)。
[0137] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所述抗體是人IgGl亞類或人IgG4亞類的。在一個(gè)實(shí) 施方案中，本文所述抗體是人IgGl亞類的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述抗體是人IgG4亞類 的。
[0138] 在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的抗體包含自人起源衍生的Fc部分和優(yōu)選人恒定 區(qū)的所有其它部分。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"自人起源衍生的Fc部分"意指Fc部分是亞類 IgGl，IgG2，IgG3或IgG4的人抗體的化部分，優(yōu)選來(lái)自人IgGl亞類的化部分，來(lái)自人IgGl亞 類的突變Fc部分(在一個(gè)實(shí)施方案中，具有突變L234A+L235A)，來(lái)自人IgG4亞類的Fc部分或 來(lái)自人IgG4亞類的突變Fc部分(在一個(gè)實(shí)施方案中，具有突變S228P)。
[0139] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述抗體特征在于恒定鏈?zhǔn)侨似鹪吹?。此類恒定鏈?zhǔn)乾F(xiàn) 有技術(shù)公知的且記載于例如Kabat，E.A.(參見(jiàn)例如John son, G. and Wu, T.T. ,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。
[0140] 本發(fā)明包含治療需要治療的患者的方法，其特征在于對(duì)患者施用治療有效量的本 文所述抗ANG2抗體及治療有效量的CD40激動(dòng)劑(例如激動(dòng)性CD40抗體）。本發(fā)明包含本文所 述抗ANG2抗體及CD40激動(dòng)劑(例如激動(dòng)性CD40抗體)用于所述療法的用途。
[0141] 本文所述抗體優(yōu)選是通過(guò)重組手段生成的。此類方法是現(xiàn)有技術(shù)廣泛知道的，而 且包含原核和真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)及隨后抗體多膚的分離且通常純化至藥學(xué)可接受 純度。為了蛋白質(zhì)表達(dá)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將編碼輕和重鏈或其片段的核酸插入表達(dá)載體中。在 適宜原核或真核宿主細(xì)胞(諸如C冊(cè)細(xì)胞，NSO細(xì)胞，SP2/0細(xì)胞，肥K293細(xì)胞，COS細(xì)胞，酵母， 或大腸桿菌細(xì)胞)中實(shí)施表達(dá)，并自細(xì)胞（自上清液或在細(xì)胞裂解后）回收抗體。
[0142] 抗體的重組生成是現(xiàn)有技術(shù)公知的且記載于例如綜述性文章 Makrides，S.C.， Protein Expr.化rif.17(1999)183-202;Geisse，S.，et al.,Protein Expr.化rif.8 (1996)271-282;Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner，R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
[0143] 抗體可W存在于全細(xì)胞中，細(xì)胞裂解物中，或部分純化的形式，或?qū)嵸|(zhì)性純的形 式。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括堿/SDS處理，CsCl成帶，柱層析，瓊脂糖凝膠電泳，和本領(lǐng)域公知的 其它技術(shù))實(shí)施純化W消除其它細(xì)胞成分或其它污染物，例如其它細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)。參見(jiàn) Ausubel，F(xiàn).，et al.，ed.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
[0144] NSO細(xì)胞中的表達(dá)記載于例如Barnes,L.M.，et al.，切totechnology 32(2000) 109-123;Barnes，L.M.，et al. ,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270。瞬時(shí)表達(dá)記載于例如 Durocher，Y.，et al.，Nucl. Acids. Res. 30 (2002 化9?？勺冇虻目寺∮涊d于 Or Iandi，R.，et a I .，P r O C . N a 11 . A C a d . S C i . U S A 8 6 ( I 9 8 9 ) 3 8 3 3 - 3 8 3 7 ; C a r t e r，P .，e t a I .， Pro C. Nat I . Acad . Sci. USA 89(I 992)4285-4289;Norderhaug，L.，et a I .， J.Immunol.Methods 204(1997)77-87。SchIaeger，E.-J.and Christensen，K.，in 切totechnology 30(1999)71-83及Schlaeger'E.-J.，in J.Immunol.Methods 194(1996) 191-199記載了一種優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)化EK 293)。
[0145] 將依照本發(fā)明的重和輕鏈可變域與啟動(dòng)子，翻譯起始，恒定區(qū)，3'非翻譯區(qū)，聚腺 巧酸化，和轉(zhuǎn)錄終止的序列組合W形成表達(dá)載體構(gòu)建物?？蒞將重和輕鏈表達(dá)構(gòu)建物組合 成單一載體，共轉(zhuǎn)染，連續(xù)轉(zhuǎn)染，或分開(kāi)轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，然后融合宿主細(xì)胞W形成表達(dá) 運(yùn)兩條鏈的單一宿主細(xì)胞。
[0146] 例如，對(duì)于原核生物合適的控制序列包括啟動(dòng)子，任選的操縱基因序列，和核糖體 結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和聚腺巧酸化信號(hào)。
[0147] 當(dāng)核酸放置成與另一核酸序列處于功能性關(guān)系時(shí)，它是"可操作連接的"。例如，如 果前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)的DNA表達(dá)成參與多膚的分泌的前蛋白（pr邱rotein)， 那么它與多膚的DNA可操作連接;如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它與該序 列可操作連接;或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的定位推動(dòng)翻譯，那么它與編碼序列可操作連接。 通常，"可操作連接"意味著所連接的DNA序列是郵鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中是郵鄰且 在同一讀碼框的。然而，增強(qiáng)子不必是郵鄰的。連接通過(guò)方便的限制性位點(diǎn)處的連接來(lái)實(shí) 現(xiàn)。如果不存在此類位點(diǎn)，那么依照常規(guī)實(shí)踐使用合成寡核巧酸銜接頭或接頭。
[0148] 通過(guò)常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程將單克隆抗體與培養(yǎng)液恰當(dāng)分開(kāi)，諸如例如蛋白A-Se地arose,徑憐灰石層析，凝膠電泳，透析，或親和層析。編碼單克隆抗體的DNA和RNA易于 使用常規(guī)規(guī)程來(lái)分離和測(cè)序。雜交瘤細(xì)胞可充當(dāng)此類DNA和RNA的來(lái)源。一旦分離，就可W將 DNA插入表達(dá)載體中，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入其它情況下不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主 細(xì)胞(諸如肥K 293細(xì)胞，C冊(cè)細(xì)胞，或骨髓瘤細(xì)胞）中，W在宿主細(xì)胞中獲得重組單克隆抗體 的合成。
[0149] 如本文中使用的，表述"細(xì)胞"，"細(xì)胞系"，和"細(xì)胞培養(yǎng)物"可互換使用，而且所有 此類名稱包括后代。如此，詞語(yǔ)"轉(zhuǎn)化子"和"經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞"包括原代受試細(xì)胞及自其衍生的 培養(yǎng)物，不管傳代的次數(shù)。還要理解的是，由于有意或無(wú)意的突變，所有后代在DNA內(nèi)容方面 可W不是精確相同的。包括具有與初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中所篩選的相同的功能或生物學(xué)活性的變 體后代。
[0150] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明的一種或一組單克隆抗體或其抗原結(jié)合部 分，與藥學(xué)可接受載劑一起配制的組合物，例如藥物組合物。
[0151] 如本文中使用的，"藥學(xué)可接受載劑"包括任何和所有溶劑，分散介質(zhì)，涂層，抗細(xì) 菌和抗真菌劑，等張和吸收/再吸收延遲劑，等等是生理學(xué)相容的。優(yōu)選的是，載劑適合于注 射或輸注。
[0152] 本發(fā)明的組合物可W通過(guò)多種本領(lǐng)域已知方法來(lái)施用。正如技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)的， 施用路徑和/或模式會(huì)根據(jù)期望結(jié)果而變化。
[0153] 藥學(xué)可接受載劑包括無(wú)菌含水溶液或分散體和用于制備無(wú)菌可注射溶液或分散 體的無(wú)菌粉末。此類介質(zhì)和藥劑對(duì)于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域已知的。在水W外，載劑 還可W是例如等張緩沖鹽水溶液。
[0154] 不管所選擇的施用路徑，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的常規(guī)方法將可W W合適水合 形式使用的本發(fā)明的化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物配制成藥學(xué)可接受劑量形式。
[0155] 本發(fā)明的藥物組合物中活性組分的實(shí)際劑量水平可W變化，從而獲得活性組分對(duì) 特定患者，組合物，和施用模式有效實(shí)現(xiàn)期望治療性應(yīng)答，對(duì)患者無(wú)毒的量(有效量）。所選 擇的劑量水平會(huì)取決于多種藥動(dòng)學(xué)因素，包括所采用的本發(fā)明特定組合物或其醋，鹽或酷 胺的活性，施用路徑，施用時(shí)間，所采用的特定化合物的排泄速率，與所采用的特定組合物 組合使用的其它藥物，化合物和/或材料，所治療的患者的年齡，性別，重量，狀況，整體健康 和在先醫(yī)學(xué)史，及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的類似因素。
[0156] 術(shù)語(yǔ)"方法治療"或其等同語(yǔ)在應(yīng)用于例如癌癥時(shí)指設(shè)計(jì)成減少或消除患者中癌 細(xì)胞的數(shù)目，或減輕癌癥的癥狀的規(guī)程或作用過(guò)程。癌癥或其它增殖性病癥的"治療方法" 并非必然表示癌細(xì)胞或其它病癥事實(shí)上會(huì)消除，細(xì)胞或病癥的數(shù)目事實(shí)上會(huì)減少，或癌癥 或其它病癥的癥狀事實(shí)上會(huì)減輕。通常，即使成功的可能性較低，都是鑒于患者的醫(yī)學(xué)史和 估算存活預(yù)期，仍然認(rèn)為誘導(dǎo)總體有益作用過(guò)程，也會(huì)實(shí)施治療癌癥的方法。
[0157] 術(shù)語(yǔ)"組合施思'或"共施思V'組合療法"，"一起施用"或"組合治療"指例如作為 分開(kāi)的配制劑/應(yīng)用(或作為單一配制劑/應(yīng)用)施用本文所述抗ANG2抗體，和本文所述激動(dòng) 性CD40抗體。共施用可W是同時(shí)的或者是任意次序順序的，其中優(yōu)選有一段時(shí)間所有活性 劑同時(shí)發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。同時(shí)或順序(例如靜脈內(nèi)（i.v.)，經(jīng)由連續(xù)輸注)共施用所 述抗體和所述別的藥劑。在順序共施用運(yùn)兩種治療劑時(shí)，或是在同一天W兩次分開(kāi)的施用 藥劑，或是在第1天施用一種藥劑并在第2天至第7天，優(yōu)選第2天至第4天共施用第二種藥 劑。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"順序"表示在第一種成分劑量給藥之后7天內(nèi)，優(yōu)選的是 在第一種成分劑量給藥的之后4天內(nèi)；而術(shù)語(yǔ)"同時(shí)"表示在相同的時(shí)間。術(shù)語(yǔ)"共施用"就抗 ANG2抗體和/或激動(dòng)性CD40抗體的維持劑而言表示維持劑可W同時(shí)共施用，如果治療周期 對(duì)兩種藥物都是適宜的話，例如每周?；蛘?，例如，每個(gè)第一天至第=天施用另一藥劑，并且 每周施用所述抗體?；蛘?，順序共施用維持劑，或是在一天內(nèi)或是在幾天內(nèi)。
[0158] 不言自明的是，W "治療有效量"（或簡(jiǎn)單的說(shuō)，"有效量"）將抗體施用于患者，該量 的相應(yīng)化合物或組合會(huì)引發(fā)研究人員，獸醫(yī)，醫(yī)生或其他臨床醫(yī)師尋求的組織，系統(tǒng)，動(dòng)物 或人的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答。
[0159] 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"患者"或"受試者"優(yōu)選指需要治療癌癥，或癌前狀況或損 害的人。然而，術(shù)語(yǔ)"患者"也可W指需要治療的非人動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，諸如小鼠，犬，貓， 馬，牛，豬，綿羊和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物，等等。
[0160] 共施用的量和共施用的時(shí)機(jī)會(huì)取決于所治療的患者的類型（物種，性別，年齡，重 量，等)和狀況及所治療的疾病或疾患的嚴(yán)重程度。所述抗ANG2抗體和別的藥劑W-次或在 一系列治療里(例如在同一天或在次日）恰當(dāng)?shù)毓彩┯糜诨颊摺?br>[0161]根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，約0.1 mg/kg至50mg/kg(例如0. l-20mg/kg)所述抗 ANG2抗體和/或激動(dòng)性CD40抗體是運(yùn)兩種藥物共施用于患者的初始候選劑量。本發(fā)明包含 依照本發(fā)明的抗體用于治療罹患癌癥(尤其是結(jié)腸癌，卵巢癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，胃癌，膜腺 癌，乳腺癌，肺癌，肝細(xì)胞癌）的患者的用途。
[0162]在抗ANG2抗體與激動(dòng)性CD40抗體的組合W外，還可W施用化療劑。
[0163]在一個(gè)實(shí)施方案中，可W與本文所述抗ANG2抗體和本文所述激動(dòng)性CD40抗體一起 施用的此類別的化療劑包括但不限于抗腫瘤劑，包括燒化劑，包括:氮芥，諸如二氯甲基二 乙胺(1116油1〇'61：11日111；[]16)、環(huán)憐酷胺（。7(31〇地03911日1111(16)、異環(huán)憐酷胺（1；1!'〇3'日1111(16)、美法 侖(melphalan)和苯下酸氮芥（chlorambucil);亞硝基脈(nitrosourea )，諸如卡莫司汀 (carmustine) (BCNU)、洛莫司?。↖omustine) (CCNU)、和司莫司?。╯emustine) (methyl-CCNU);Temodal?(替莫挫胺（temozolamide))、乙撐亞胺/甲基蜜胺諸如S乙撐蜜胺（TEM)、 ^乙締硫代憐酷胺(塞替派(1：11；[01：巧曰））、六甲基蜜胺(歷1，六甲蜜胺(曰1付61曰1]1；[]16));控基 橫酸醋，諸如白消安（busulfan);S嗦，諸如達(dá)卡己嗦（daca;rbazine)(DTIC);抗代謝物，包 括葉酸類似物，諸如甲氨噪嶺(methohexate)和S甲曲沙（trimetrexate)，喀晚類似物，諸 如5-氣尿喀晚（5即）、氣脫氧尿巧、吉西他濱(gemci1:abine)、胞喀晚阿拉伯糖巧(AraC，阿糖 胞巧k^arabine))、5-氮胞巧、2，2 ' -二氣脫氧胞巧，嚷嶺類似物，諸如6-琉基嚷嶺、6-硫鳥(niǎo) 嚷嶺、硫挫嚷嶺（azathiop;rine)、T-脫氧柯福霉素（噴司他下（pentostatin))、 e巧throhyhownonyladenine化HNA)、憐酸氣達(dá)拉濱（f Iudarabine phosphate)、和2-氯脫 氧腺巧(克拉屈濱(Cladribine)，2-CdA);天然產(chǎn)物，包括抗有絲分裂藥物，諸如帕利他賽 (paclitaxel)、長(zhǎng)春花生物堿（包括長(zhǎng)春堿(vinblastine) (VLB)、長(zhǎng)春新堿（vincristine)、 和長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine))、泰索帝（taxotere)、雌莫司?。╡stramustine)、和憐酸雌莫司 ?。槐砉戆锥舅兀╬ipodophylotoxin)，諸如依托泊巧（etoposide)和替尼泊巧 (teniposide);抗生素，諸如放線菌素 D(actinomycin D)、道諾霉素（daunomycinK柔紅霉 素（rubidomycin))、多柔比星（doxorubicin)、米托蔥釀（mitoxantrone)、伊達(dá)比星 (idarubicin)、博來(lái)霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)(光輝霉素(mit虹amycin))、 絲裂霉素 〔(mitomycin C)、和放線菌素(actinomycin);酶，諸如k天冬酷胺酶;生物學(xué)應(yīng)答 改性劑，諸如干擾素-Q、化-2、G-CSF和GM-CSF;包括銷配位復(fù)合物的混雜劑，諸如奧沙利銷 (oxaliplatin)、順?shù)N（Cisplatin)和卡銷（carboplat in)，蔥二酬，諸如米托蔥釀 (mitoxantrone)，取代的脈，諸如徑基脈、甲基阱衍生物，包括N-甲基阱(MIH)和丙卡己阱 (procarbazine)、腎上腺皮質(zhì)阻抑劑，諸如米托坦（mitotane) (0、p-DDD)和氨魯米特 (aminoglutethimide);激素和括抗劑，包括腎上腺皮質(zhì)類固醇括抗劑，諸如強(qiáng)的松 (prednisone)及等效物、地塞米松（dexamethasone)和氨魯米特（aminoglutethimide); Gemzar?(吉西他濱（gemcitabine))、妊娠素，諸如己酸徑基孕酬化yho巧progesterone caproate)、乙酸甲徑孕酬（me化oxyprogesterone acetate)和乙酸甲地孕酬（megeshol acetate);雌激素，諸如己締雌酪(diethyIsti Aestrol)和乙烘雌二醇等效物;抗雌激素， 諸如他莫昔芬（tamoxifen);雄激素，包括丙酸睪酬（testosterone propionate)和氣甲睪 酬(f Iuoxymesterone)/等效物;抗雄激素，諸如氣他胺（f Iutamide )、促性腺激素釋放激素 類似物和亮丙瑞林Qeuprolide);和非類固醇抗雄激素，諸如氣他胺(flu化mide)。祀向后 成機(jī)制的療法包括但不限于組蛋白脫乙酷基酶抑制劑，脫甲基化劑(例如Vidaza)和釋放轉(zhuǎn) 錄阻抑(ATRA)療法也可W與抗原結(jié)合蛋白質(zhì)組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑選自下組:紫 杉燒(像例如帕利他賽(泰素(Taxol))、多西他賽(泰索帝(Taxotere))、經(jīng)修飾的帕利他賽 (例如Abraxane和Opaxio)、多柔比星、舒尼替尼（Sutent)、索拉非尼(Nexavar)、和其它多激 酶抑制劑、奧沙利銷、順?shù)N和卡銷、依托泊巧、吉西他濱、和長(zhǎng)春堿。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療 劑選自下組：紫杉燒(像例如帕利他賽(Taxol)、多西他賽(Taxotere)、經(jīng)修飾的帕利他賽 (例如Abraxane和Opaxio)。在一個(gè)實(shí)施方案中，別的化療劑選自5-氣尿喀晚（5-FU)、亞葉 酸、伊立替康、或奧沙利銷。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑為5-氣尿喀晚、亞葉酸和伊立替康 (FOLFIRI)。在一個(gè)實(shí)施方案中，化療劑為5-氣尿喀晚和奧