一種雙靶向超聲造影劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及超聲造影劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雙靶向超聲造影劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的超聲造影劑是以磷脂、白蛋白等膜材料包裹氣體制備而成的微泡，這些含氣微泡的粒徑大小約數(shù)個微米，在體內(nèi)具有與紅細(xì)胞類似的特征，能夠通過體循環(huán)及肺循環(huán)，在臨床上多用以顯示整個血池系統(tǒng)的分布及完整性。靶向超聲造影劑與普通造影劑最顯著的區(qū)別就是能夠在分子水平上識別靶組織的特異性抗原表位，并與之牢固結(jié)合，最終使靶組織特異性顯影。為了達(dá)到這一目的，就必須對造影劑進(jìn)行靶向修飾。
[0003]目前國內(nèi)外研究中較常用的方法主要有以下兩種:
[0004]—種方法是，在造影劑外膜成分中加入對某一疾病特異性位點具有親和力的成分，以達(dá)到革G向的目的。Christiansen JP等人將磷脂酰絲氨酸添加入微泡外膜成分中，使其能夠革巴向附著炎癥區(qū)域中活化的中型粒細(xì)胞及單核細(xì)胞(Christiansen JP,Leong-PoiHjKlibanov AL,et al.Noninvasive imaging of myocardial reperfus1n injuryusing leukocyte-targeted contrast echocard1graphy circulat1n 2002；105(15):1764-1767)。而劉學(xué)兵等人在造影劑膜成分中加入了硫酸腦苷脂，后者對腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的糖蛋白有特殊親和力，從而成功制備了一種針對腫瘤組織的靶向造影劑(劉學(xué)兵，王志剛，許川山，等.納米級靶向超聲造影劑的制備及對兔VX2肝腫瘤的顯影試驗.中國超聲醫(yī)學(xué)雜志，2009;25(1):5-8)。但是總體而言，這種修飾方式適用的靶點有限，并不能在臨床上得到廣泛應(yīng)用。微泡與靶細(xì)胞并非特異性結(jié)合，勢必影響其對疾病的診斷及治療效果。
[0005]另一種方法是，運用針對某種疾病特異位點的配體(如抗體、肽等)對造影劑微泡外殼進(jìn)行修飾?？乖?抗體的結(jié)合具有高度的特異性及親和性，因此，只要找到感興趣疾病的特征性位點，制備出高特異性及敏感性的革G向造影劑就成為可能。Lindner JR等通過生物素-抗生物素的橋接作用，使結(jié)合有抗P-選擇素抗體的脂類微泡與活化白細(xì)胞表面的P選擇素特異結(jié)合，提高微泡在炎癥區(qū)域的滯留，從而對小鼠腎臟的缺血后炎癥損傷進(jìn)行早期檢測(Lindner JR , Song J , Chri stiansen J , et al.Ultrasound assessment ofinflammat1n and renal tissue injury with microbubbles targeted to P-selectin.Circulat1n 2001 ； 104( 17): 2107-2112.) offeller GE等以細(xì)胞黏附分子-1(ICAM-1)為靶點制備出靶向造影劑應(yīng)用于接受心臟移植的大鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，植入組織配型不合心臟的大鼠超聲圖像上造影劑信號強度明顯高于植入組織配型匹配心臟的大鼠(WellerGER,Lu E,Csikari MM,et al.Ultrasound imaging of acute cardiac transplantreject1n with microbubbles targeted to intercellular adhes1n molecule-1.Circulat1n 2003; 108(2): 218-224.)。這種方法雖然通過單克隆抗體等特異性配體的使用，能夠?qū)崿F(xiàn)微泡與靶細(xì)胞的特異性結(jié)合，但是由于單一靶點的設(shè)計，微泡在靶組織內(nèi)很難達(dá)到理想濃度，從而影響其攜帶基因在靶組織內(nèi)的濃度，進(jìn)而影響后續(xù)的基因治療。
[0006]綜上所述，目前的靶向造影劑能夠?qū)崿F(xiàn)與靶細(xì)胞的特異性結(jié)合，但是單靶點設(shè)計的微泡只能與單一靶點結(jié)合，受血流剪切力的影響，單靶向微泡與靶組織往往不能緊密黏附，靶向能力低。這種缺陷在針對乳腺癌的造影劑中表現(xiàn)明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供一種雙靶向超聲造影劑及其制備方法，通過不同靶點的聯(lián)合應(yīng)用，可以有效提高造影劑的靶向效能，大幅提高其攜帶基因在靶組織的富集程度。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種雙靶向超聲造影劑，該造影劑是IntegrincOVMCP-1雙靶向微泡，該雙靶向微泡包括脂質(zhì)外殼和氣體內(nèi)芯，上述脂質(zhì)外殼的外表面連接有Integr?ηανβ3(整合素ανβ3)單克隆抗體和MCP-1 (單核細(xì)胞趨化蛋白-1，Monocyte Chemotactic Protein I)單克隆抗體。
[0009]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述脂質(zhì)外殼包括DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)、Stearic-PEI600(硬脂酸支鏈聚醚酰亞胺-600)、DSPE-PEG2000-B1tin(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素)。更優(yōu)選地，上述DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin的摩爾比為7.5?9.5:0.1?1:0.4?1.5，最優(yōu)選為8.5:0.5:1。
[0010]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述氣體內(nèi)芯是全氟丙烷內(nèi)芯。
[0011 ]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述Integrinaj3單克隆抗體和MCP-1單克隆抗體為生物素化單克隆抗體;上述脂質(zhì)外殼與上述單克隆抗體通過親和素和生物素連接在一起。
[0012]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述Integrinaj3單克隆抗體和MCP-1單克隆抗體的摩爾比為0.5?2:0.5?2，更優(yōu)選為1:1。
[0013]作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方案，上述脂質(zhì)外殼包括DSPCX二硬脂酰磷脂酰膽堿)、Stearic-PEI600(硬脂酸支鏈聚醚酰亞胺-600)、DSPE-PEG2000-B1tin(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素)，上述氣體內(nèi)芯是全氟丙烷內(nèi)芯，上述單克隆抗體是生物素化單克隆抗體，上述DSPE-PEG2000_B1tin連接親和素，上述親和素連接上述單克隆抗體。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種制備第一方面的雙靶向超聲造影劑的方法，該方法包括如下步驟:
[0015](I)將DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin溶解在三氯甲烷中；
[0016](2)在惰性氣流作用下除去上述三氯甲烷，使上述DSPC'Stearic-PEieOCKDSPE-pEGSOOO-B1tin 在容器壁上形成均勻薄膜；
[0017](3)加入水性溶液后振蕩至透明，然后分裝于密封瓶中；
[0018](4)用全氟丙烷置換瓶內(nèi)空氣，振蕩后制得生物素化微泡；
[0019](5)向上述生物素化微泡中加入親和素，并在室溫下孵育；
[0020](6)加入Integrinaj3和MCP-1的生物素化單克隆抗體，室溫下孵育，制得上述雙靶向超聲造影劑。
[0021]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000-B1tin 的摩爾比為7.5?9.5:0.1?1:0.4?1.5，更優(yōu)選為8.5:0.5:1。
[0022]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述Integrinaj3和MCP-1的生物素化單克隆抗體的摩爾比為0.5?2:0.5?2，更優(yōu)選為1:1。
[0023]作為本發(fā)明的最優(yōu)選的方案，上述方法包括如下步驟:
[0024](I)將摩爾比為 8.5:0.5:1 的 DSPC、Stearic-PEI600、DSPE-PEG2000_B1tin 溶解在三氯甲烷中；
[0025](2)在他氣流作用下除去三氯甲烷，使磷脂在試管壁上形成均勻薄膜；
[0026](3)加入0.1M Tris緩沖溶液后置于水浴式超聲振蕩器中振蕩至透明，分裝于潔凈西林瓶中密封；
[0027](4)用全氟丙烷置換瓶內(nèi)空氣，置于機械振蕩器振蕩30s后制得生物素化微泡；
[0028](5)將其加入PBS離心清洗后，取1mL微泡加入50yg親和素，室溫下孵育20min;
[0029](6)再次離心后加入過量的摩爾比為1:1生物素化Integrinaj3及MCP-1單克隆抗體，室溫下孵育20min，即制得Integrinav03/MCP-l雙革E向微泡的造影劑。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種雙靶向載基因超聲造影劑，該雙靶向載基因超聲造影劑包括如第一方面的雙靶向超聲造影劑以及包裹于上述雙靶向超聲造影劑的微泡內(nèi)的重組質(zhì)粒。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種制備第三方面的雙靶向載基因超聲造影劑的方法，該方法包括將如第一方面的雙靶向超聲造影劑與重組質(zhì)?；旌喜⒎跤?。
[0032]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的超聲造影劑具有如下優(yōu)勢:本發(fā)明采用IntegrinavP3和MCP-1雙靶向設(shè)計，將這兩個在乳腺癌組織中高表達(dá)的位點結(jié)合起來，使得微泡的靶向效率得以提高，能夠大幅提高其攜帶基因在靶組織的富集程度。同時，本發(fā)明的造影劑是一種兼具顯影和治療雙功能的超聲造影劑，通過超聲成像系統(tǒng)可實時、準(zhǔn)確地觀察腫瘤成像;通過高強度超聲輻照實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染后，可達(dá)到腫瘤基因治療的效果。此外，在本發(fā)明的優(yōu)選的方案中，將Stearic-PEI600加入成膜材料中，制得的微泡表面帶正電荷，與質(zhì)粒的吸附作用更強。
【附圖說明】
[0033]圖1為本發(fā)明一個實施例的雙靶向載基因超聲造影劑的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0034]圖2為本發(fā)明一個實施例制備的雙靶向超聲造影劑混懸液。
[0035]圖3為本發(fā)明一個實施例制備的雙靶向超聲造影劑超聲顯影成像圖。
[0036]圖4為本發(fā)明一個實施例中4組超聲造影劑與MCF-7細(xì)胞靶向結(jié)合情況，其中A顯示非靶向微泡組:未見微泡與MCF-7黏附;B顯示Integrinaj3單靶向微泡組:可見少量微泡與MCF-7黏附；C顯示MCP-1單靶向微泡組:可見少量微泡與MCF-7黏附；D顯示IntegrinaJ3/MCP-1雙靶向微泡組:可見大量微泡與MCF-7黏附。
[0037]圖5為本發(fā)明一個實施例中4組超聲造影劑的靶向顯影效果情況，其中A顯示非靶向