免疫原性增強(qiáng)的多糖-蛋白質(zhì)綴合物及其快速高產(chǎn)的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫原性增強(qiáng)的多糖-蛋白質(zhì)綴合物以及獲得所述多糖-蛋白質(zhì)綴合 物的快速高產(chǎn)的綴合方法。更特別地，本發(fā)明提供了使用用于產(chǎn)生增強(qiáng)免疫原性的優(yōu)化多 糖鏈長(zhǎng)度來(lái)開(kāi)發(fā)的多糖蛋白質(zhì)綴合物疫苗。本發(fā)明還涉及用于使多糖與載體蛋白質(zhì)綴合的 具有提高的產(chǎn)率和更高的免疫原性的還原胺化快速方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 疫苗接種(免疫接種)是引發(fā)免疫應(yīng)答的方式。疫苗接種的方法包括向活的實(shí)體施 用疫苗，這繼而激活人體的自然免疫系統(tǒng)。疫苗包含小劑量的抗原，其為減弱的病原體或死 病原體(例如細(xì)菌或病毒或病原體結(jié)構(gòu)的一部分)的制備物，其在施用后刺激抗體產(chǎn)生或針 對(duì)病原體的細(xì)胞免疫。
[0003] 在免疫學(xué)上，可將抗原分類為T細(xì)胞依賴性(TD)抗原或T-細(xì)胞非依賴性(TI)抗原。 蛋白質(zhì)和肽通常是TD抗原并且需要來(lái)自輔助T淋巴細(xì)胞的刺激以便引發(fā)免疫應(yīng)答，并且由 于記憶B和T淋巴細(xì)胞的形成而誘導(dǎo)持久的免疫應(yīng)答。與此相反，TI抗原刺激B細(xì)胞增殖和分 化成分泌抗體的效應(yīng)細(xì)胞，無(wú)需T細(xì)胞的幫助并且不形成記憶B和T淋巴細(xì)胞。大多數(shù)這些T 細(xì)胞依賴性抗原是刺激產(chǎn)生低親和力抗體的微生物多糖。
[0004] 在革蘭氏陰性菌中，在細(xì)菌莢膜中存在的多糖是顯示出差的免疫原性的重要毒力 因子。綴合物疫苗是微生物多糖（polysaccharide，PS)抗原與載體蛋白質(zhì)（carrier protein，CP)偶聯(lián)的產(chǎn)物，從而將T細(xì)胞非依賴性免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變成T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答。使 用綴合物疫苗來(lái)免疫嬰兒和兒童以抵抗包含莢膜多糖的細(xì)菌引起的侵入性疾病?？乖郧v 膜多糖與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)產(chǎn)生高度免疫原性的綴合物。
[0005] 碳水化合物-蛋白質(zhì)綴合物在基礎(chǔ)研究中被廣泛使用并且作為多種細(xì)菌疫苗中的 免疫原。已經(jīng)付出了巨大的努力來(lái)開(kāi)發(fā)用于構(gòu)建這些綴合物的簡(jiǎn)單且可靠的方法。雖然通 過(guò)還原胺化進(jìn)行直接偶聯(lián)是有有吸引力的方法，但其同樣具有許多缺點(diǎn)。通過(guò)還原胺化的 現(xiàn)有綴合方法是耗時(shí)且低產(chǎn)率的方法，同時(shí)如此得到的綴合物顯示出較低的免疫原性。
[0006] 多糖-蛋白質(zhì)綴合物的免疫學(xué)性能是長(zhǎng)度依賴的，可能需要優(yōu)化多個(gè)表位也是一 個(gè)公認(rèn)的事實(shí)(Costantino等，1999)。還已知較小多糖片段的選擇性末端基團(tuán)活化方法以 一致的再現(xiàn)性產(chǎn)生了很好地限定了綴合物疫苗。較大尺寸的多糖分子可具有空間上隱藏的 表位，然而較小的片段在綴合后將具有暴露于免疫系統(tǒng)的最大表位。
[0007]已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于制備較小的多糖片段的數(shù)種方法，包括多糖的解聚。在現(xiàn)有技術(shù) 中已充分地描述了多糖的解聚。例如，Laferriere等，2011年的文章 "Experimental design to optimize an Haemophilus influenzae typeb conjugate vaccine made with hydrazide-derivatized tetanus toxoid"對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的描述一個(gè)主要的缺點(diǎn)是該 方法花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí)間（32小時(shí)以上），并具有約15%的綴合物產(chǎn)率。Anderson等，1986年也描 述了使用較小尺寸的多糖用于與白喉類毒素綴合，并發(fā)現(xiàn)由20個(gè)重復(fù)單元的Hib-PRP制成 的綴合物比由8個(gè)重復(fù)單元制成的那些具有更強(qiáng)的免疫原性。他們的方法也花費(fèi)很長(zhǎng)的時(shí) 間，即超過(guò)5天。
[0008]本發(fā)明通過(guò)提供用于使多糖與載體蛋白質(zhì)綴合的具有提尚的廣率和更尚的免疫 原性的還原胺化的快速方法克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。本發(fā)明的方法需要較短的綴合時(shí)間。 本發(fā)明還提供了通過(guò)向免疫系統(tǒng)更好地暴露抗原表位的免疫原性增強(qiáng)的小尺寸多糖。
[0009] 發(fā)明目的
[0010] 因此，本發(fā)明的主要目的是提供免疫原性增強(qiáng)的多糖-蛋白質(zhì)綴合物。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于多糖片段化的化學(xué)方法。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于流感嗜血桿菌（Haemophilus inf luenzae)b型 (Hib)的免疫原性增強(qiáng)的較低分子量(Lower Molecular Weight，LMff)多糖蛋白質(zhì)綴合物疫 苗。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清 組A和C(MenA和MenC)的免疫原性增強(qiáng)的較高分子量(Higher Molecular Weight，HMW)多糖 蛋白質(zhì)綴合物疫苗。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供獲得具有較短綴合時(shí)間和更高綴合物產(chǎn)率的多糖-蛋 白質(zhì)綴合物的快速方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 因此，本發(fā)明提供了免疫原性增強(qiáng)的多糖-蛋白綴合物和獲得所述多糖-蛋白質(zhì)綴 合物及其疫苗的快速高產(chǎn)率綴合方法。
[0016] 本發(fā)明提供了優(yōu)化分子量的多糖-蛋白質(zhì)綴合物，其中多糖被片段化成分子量在 100±40kD的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地具有約100kD的平均分子量。
[0017] 本發(fā)明還提供了制備Hib多糖-蛋白質(zhì)綴合物的優(yōu)化的低分子量多糖，其中多糖片 段被片段化為分子量在12±6kD的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地具有約10kd的平均分子量。
[0018] 本發(fā)明還公開(kāi)了用于將Hib莢膜多糖（即PRP(聚核糖基-核糖醇-磷酸））化學(xué)分解 為12±6kD的尺寸的具有較低多分散性且具有可再現(xiàn)性結(jié)果的方法。
[0019] 本發(fā)明還公開(kāi)了用于將天然莢膜多糖(例如但不限于MenA和MenC)化學(xué)分解為100 ±40kD的尺寸的方法，其示出了可再現(xiàn)結(jié)果的低多分散性。
[0020] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了多糖的化學(xué)降解，其中將所述多糖樣品 與偏高碘酸鈉（sodium-metaperiodate)放在一起保持預(yù)定的時(shí)間并在凝膠過(guò)濾柱上直接 脫鹽。
[0021] 純化所述的多糖樣品并對(duì)純化的多糖進(jìn)行分析測(cè)定用以評(píng)估物理化學(xué)性質(zhì)，包括 PS含量、唾液酸含量、磷含量、蛋白質(zhì)雜質(zhì)、核酸雜質(zhì)、內(nèi)毒素、同一"性以及水分含量。分析純 化的多糖的總含量并通過(guò)產(chǎn)生醛基進(jìn)行衍生化。
[0022] 本發(fā)明還提供了多糖-蛋白質(zhì)綴合物，其中可在較小的多糖片段上進(jìn)行選擇性的 末端基團(tuán)活化。對(duì)于Hib多糖和腦膜炎球菌血清組，典型的多糖被氧化劑(例如偏高碘酸鹽/ 酯(metaperiodate))分別片段化為約10kD和100kD的較小質(zhì)量，并使用還原胺化化學(xué)將其 與衍生化的載體蛋白質(zhì)綴合。
[0023] 載體蛋白質(zhì)是破傷風(fēng)類毒素、CRM197或其他合適的載體蛋白質(zhì)，其被激活并分析 蛋白質(zhì)含量和活化度(degree of activation)。在催化試劑的存在下，使用一水合肼作為 接頭將肼基團(tuán)與載體蛋白質(zhì)連接。所述催化試劑的非限制性實(shí)例是HXX1-乙基-3-(3-二甲 氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽）。
[0024] 綴合步驟包括衍生化的多糖與衍生化的載體蛋白質(zhì)（例如破傷風(fēng)類毒素）的綴合。 進(jìn)一步純化多糖-蛋白質(zhì)綴合物并分析蛋白質(zhì)含量與多糖含量之比、游離多糖、尺寸分布和 效力。
[0025] 本發(fā)明還進(jìn)行了對(duì)多糖-蛋白質(zhì)綴合物的物理化學(xué)分析的分析。在實(shí)驗(yàn)的每個(gè)階 段，即，對(duì)于初始多糖樣品、活化的糖、載體蛋白質(zhì)、批量綴合物(bulk con jugate)和最終的 疫苗進(jìn)行該分析。
[0026] 對(duì)于Hib，用所產(chǎn)生的綴合物對(duì)大鼠進(jìn)行免疫，對(duì)于MenA/MenC對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，并 且對(duì)血清抗體進(jìn)行滴定以評(píng)估免疫潛力。對(duì)于Hib和MenA/MenC，通過(guò)間接的IgG-ELISA確定 抗體效價(jià)(titer )，并且MenA和MenC綴合物的血清殺菌測(cè)定等于或高于用參考疫苗獲得的 那些。因此該方法成本效益好且耗時(shí)較少。
[0027] 本發(fā)明最重要的成果是使用優(yōu)化分子量的各多糖在遠(yuǎn)遠(yuǎn)更短的時(shí)間和更好的綴 合產(chǎn)率下使所產(chǎn)生的綴合物獲得更好的免疫原性。
[0028] 附圖簡(jiǎn)述
[0029]圖1描繪了還原胺化方法的示意圖。
[0030]圖2描繪了使用如通過(guò)RI檢測(cè)器所監(jiān)測(cè)到的在TSK 4000-5000PWXL柱上獲得的解 聚且活化的Hib PRP的高效液相色譜系統(tǒng)(SEC-HPLC)圖譜的尺寸排阻色譜。
[0031] 圖3a和3b描繪了如通過(guò)RI檢測(cè)器所監(jiān)測(cè)到的在TSK 4000-5000PWXL柱上活化的 MenA和MenC多糖的SEC-HPLC洗脫圖譜。
[0032] 圖4描繪了通過(guò)UV檢測(cè)器所監(jiān)測(cè)到的在TSK 4000-5000PWXL柱上Hib PRP-TT綴合 物在SEC-HPLC圖譜中的位移。
[0033]圖5描繪了PRP-TT綴合物的SDS-PAGE分析。樣品泳道含有以下：泳道1 -蛋白質(zhì)分子 量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2-低分子量的PRP-TT綴合物，泳道3-高分子量的PRP-TT綴合物，以及泳道4-天 然TT。
[0034] 圖6描繪了通過(guò)UV檢測(cè)器監(jiān)測(cè)到的TSK 4000-5000PWXL柱上MenA-TT綴合物和 MenC-TT綴合物的SEC-HPLC圖譜的位移，與游離的破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行了比較。
[0035]圖7描繪了在抑制ELISA中，MenC-TT綴合物的抗體抑制百分比的圖示。
[0036]圖8描繪了在第0、28和42天3次給藥后，通過(guò)ELISA測(cè)定大鼠中的Hib綴合物免疫原 性來(lái)確定血清IgG效價(jià)。在第0、28、42、49和70天以不同的劑量水平以及用不同尺寸的!1化 PS來(lái)評(píng)估抗體效價(jià)。
[0037] 圖9描繪了通過(guò)ELISA測(cè)定小鼠中的腦膜炎球菌血清組A綴合物免疫原性來(lái)確定血 清抗MenA IgG效價(jià)。
[0038] 圖10描繪了通過(guò)ELISA測(cè)定小鼠中的腦膜炎球菌血清組C綴合物免疫原性來(lái)確定 血清抗MenC IgG效價(jià)。
[0039] 圖11描繪了通過(guò)血清殺菌測(cè)定小鼠中的腦膜炎球菌血清組C綴合物的免疫原性來(lái) 確定抗MenC血清功能性抗體效價(jià)。
[0040] 具有舉例說(shuō)明和實(shí)施例的發(fā)明詳述
[0041] 大多數(shù)蛋白含有來(lái)自C末端官能團(tuán)和天冬氨酸以及谷氨酸側(cè)鏈的大量羧酸基團(tuán)。 這些基團(tuán)易于被親核化合物修飾以產(chǎn)生穩(wěn)定的酰亞胺產(chǎn)物。而親核官能團(tuán)易于與醛基反 應(yīng)，但其不會(huì)自發(fā)地與羧酸鹽/酯或羧酸基團(tuán)反應(yīng)。首先必須用其他化合物活化羧酸基團(tuán)以 使其對(duì)親核試劑發(fā)生反應(yīng)。在本發(fā)明中，在水溶液中用水溶性交聯(lián)劑處理所述蛋白質(zhì)以使 羧基與胺綴合。所述交聯(lián)劑的一個(gè)非限制性實(shí)例是碳二亞胺H