分離吸附容量可W 提高16% W上，運(yùn)在工業(yè)化連續(xù)純化猴頭菌中促進(jìn)NGF分泌的活性物質(zhì)特別有利，能夠大幅 降低生產(chǎn)成本。
[0031] 由于采用了本發(fā)明的提取方法，式(I)~(V)化合物中任一種化合物的純度可大于 98重量％，優(yōu)選大于99重量％，更優(yōu)選大于99.5重量％。
[0032] 本發(fā)明的所述層析純化方法的使用使得猴頭菌中結(jié)構(gòu)非常接近的活性化合物能 夠得到有效分離，所述純度就充分表明了運(yùn)一點(diǎn)。在現(xiàn)有技術(shù)的提取方法中，所述成分的純 度通常在85重量％ W下，對(duì)于式(V)化合物，其純度甚至更低。
[0033] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種制備上述試劑的方法，該方法包括將式（I)~ (V)化合物和任選的有機(jī)溶劑按前述比例混合進(jìn)行制備。
[0034] 優(yōu)選地，采用上文所述的方法，通過(guò)聯(lián)合使用硅膠柱和大孔樹脂柱進(jìn)行柱層析對(duì) 猴頭菌進(jìn)行提取來(lái)獲得式(I)~(V)化合物。
[0035] 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞NGF分泌的試劑還包含為 式（I)~（V)化合物總重量的0.5-5.0重量％，優(yōu)選1.0-3.0重量％的下式(VI)所示的化合 物：
[0037] 式(VI)化合物的加入，可W進(jìn)一步使上述試劑對(duì)于防止和/或治療腦神經(jīng)或末端 神經(jīng)功能的素亂具有更好效果;更特別地，使得該試劑的劑量減少10-30%的情況下仍可W 獲得類似的NGF分泌促進(jìn)效果。
[0038] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該化合物由于取代基的作用，比常規(guī)的糞釀更能夠促進(jìn)NGF的產(chǎn) 生，即具有更好的分泌誘導(dǎo)作用。
[0039] 在本發(fā)明中，間質(zhì)細(xì)胞優(yōu)選為化jal間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞等等。 具體實(shí)施方案
[0040] 下面結(jié)合W下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于 此。
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 采用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞:取出生7天的Wistar大乳鼠，用75%乙醇消毒， 在無(wú)菌條件下斷頭，取腦，分離出雙側(cè)海馬和皮質(zhì)，置于消毒平皿中，用少許解剖液沖洗腦 組織，再用手術(shù)刀片切成的碎塊組織，用熱處理過(guò)的粗吸管吸腦組織于另一小平皿內(nèi)，加入 適量的解剖液和膜酶，使膜酶的濃度為0.25 % ;然后在37 °C培養(yǎng)箱中消化30min，將消化后 的組織塊吸入盛有適量種植培養(yǎng)液(含20 %胎牛血清，80 %DMEM，lOmg/L谷氨酷胺）的兩支 試管中，用尖吸管吹散，lOOOr/min離屯、使細(xì)胞下沉，除去上清液，吸入IOmL接種液，用尖吸 管吹散至單個(gè)細(xì)胞，靜置，取W200目篩網(wǎng)過(guò)濾，去除未消化的組織殘?jiān)?，用血球?jì)數(shù)板計(jì)數(shù) 細(xì)胞，0.4 %臺(tái)吩藍(lán)鏡檢存活率大于95 %。用種植培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5 X lOVmL密度，接 種于涂有0.1%多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，每孔50化L，置培養(yǎng)板于37°C，5%C02培養(yǎng)箱 中，24h后吸掉種植培養(yǎng)液，即得到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，將其分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。
[0043] 在實(shí)驗(yàn)組中，每孔分別加入本發(fā)明的試劑化L/mL，繼續(xù)培養(yǎng)72h，作用時(shí)間完成后， 將上清移入無(wú)菌化pendof管，-20°C冷藏待測(cè)，同時(shí)將每孔細(xì)胞消化下來(lái)，計(jì)算其細(xì)胞總數(shù)。 在對(duì)照組中，加入含10%牛血清的培養(yǎng)基〇.5mL，采取上述同樣方法進(jìn)行培養(yǎng)和消化。
[0044] NGF的定量測(cè)定：培養(yǎng)基質(zhì)中NGF含量采用雙向化ISA法定量檢測(cè)。用酶標(biāo)儀于 450nm處W陰性對(duì)照調(diào)零后測(cè)定每孔的光密度(OD)值，根據(jù)NGF標(biāo)準(zhǔn)品和其對(duì)應(yīng)OD值，先得 出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再求出回歸方程，然后依回歸方程得出每孔樣品的NGF含量，最后NGF分泌量W 7化的"pg/105細(xì)胞"表示。
[0045] 在該實(shí)施例中，所述試劑是式（I)化合物:式（II)化合物:式（III)化合物:式（IV) 化合物:式(V)化合物W 3:3:3:10:0.5的混合物，該試劑W含50重量％丙二醇的溶液形式使 用。
[0046] 經(jīng)測(cè)量，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌NGF的量為約17.2pg/105,顯著高于對(duì)照組的約 9.化g/10 5。運(yùn)明顯表明本發(fā)明的試劑可W有效促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞NGF分泌量的增加。
[0047] 實(shí)施例2
[0048] 重復(fù)實(shí)施例1，與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于，在實(shí)驗(yàn)組中，NGF分泌促進(jìn)試劑中加入了 基于該試劑重量(包括溶劑)計(jì)1.5重量％的式(VI)化合物。經(jīng)測(cè)定，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌NGF 的量為約21.9pg/l〇5。
[0049] 由上述實(shí)施例和對(duì)照實(shí)驗(yàn)可W清楚地看出，式(VI)化合物W較小的加入量可W顯 著促進(jìn)NGF的分泌。
[0050] 本書面描述使用實(shí)例來(lái)公開(kāi)本發(fā)明，包括最佳模式，且還使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 制造和使用本發(fā)明。本發(fā)明的可授予專利的范圍由權(quán)利要求書限定，且可W包括本領(lǐng)域技 術(shù)人員想到的其它實(shí)例。如果運(yùn)種其它實(shí)例具有不異于權(quán)利要求書的字面語(yǔ)言的結(jié)構(gòu)元 素，或者如果運(yùn)種其它實(shí)例包括與權(quán)利要求書的字面語(yǔ)言無(wú)實(shí)質(zhì)性差異的等效結(jié)構(gòu)元素， 則運(yùn)種其它實(shí)例意圖處于權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。在不會(huì)造成不一致的程度下，通過(guò)參考 將本文中參考的所有引用之處并入本文中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞NGF分泌的試劑，該試劑包含下式(I)至(V)所示的化合物：其中，以重量比計(jì)，式（I)化合物:式（II)化合物:式(III)化合物:式（IV)化合物:式(V) 化合物=(2-5): (2-5): (2-5): (10-15): (0· 1-1 ·0)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其中基于該試劑的總重量計(jì)，還包含10%_70%重量的 乙酸乙酯-乙醇混合溶劑，乙酸乙酯：乙醇（重量比）= 1:3-3:1;或者包含20-60%重量的丙 二醇溶劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其中乙酸乙酯-乙醇混合溶劑的含量為30%-60%重量。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中，以重量比計(jì)，式（I)化合物:式（II)化合物:式 (ΠΙ)化合物:式(IV)化合物:式(V)化合物= 3:3:3:10:0.5。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的試劑，其中式(I)~(V)化合物均提取自猴頭菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，在式（I)~(V)化合物的提取中，聯(lián)合使用硅膠柱和大孔 樹脂柱進(jìn)行柱層析提取。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑，式（I)~（V)化合物中任一種化合物的純度大于98重 量％。8. -種制備根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述試劑的方法，該方法包括將式（I)~(V)化 合物和任選的有機(jī)溶劑按前述比例混合進(jìn)行制備。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)聯(lián)合使用硅膠柱和大孔樹脂柱進(jìn)行柱層析對(duì)猴頭 菌進(jìn)行提取來(lái)獲得式(I)~(V)化合物。10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述大孔樹脂是非極性大孔吸附樹脂。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞NGF分泌的試劑，該試劑由提取自猴頭菌的特定成分配伍而成，其能夠有效促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞NGF分泌。還公開(kāi)了該試劑的制備方法，其中特定的層析純化方法的使用使得猴頭菌中結(jié)構(gòu)非常接近的活性化合物能夠得到有效分離。
【IPC分類】A61P25/00, A61K31/164, A61K31/56, A61K31/575, A61P25/28, A61K31/122, A61K31/569
【公開(kāi)號(hào)】CN105663142
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610121400
【發(fā)明人】安沂華, 董健伸
【申請(qǐng)人】安沂華
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月3日