血流;2) LMffF可以改善下肢動脈閉塞的外周血管病大鼠足底溫度；3) LMffF減輕外周血管病大鼠腓腸肌和主動脈血管的病理改變。4 )LMWF促進下肢缺血大鼠血管側枝循環(huán)的建立和血管新生。含低分子量褐藻多糖硫酸酯的產(chǎn)品，口服可吸收，副作用少等優(yōu)點，對防治下肢外周動脈血管病具有潛在的應用意義。
【附圖說明】
[0022]圖1為低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMffF)對下肢動脈閉塞的外周血管病大鼠足底血流的影響。
[0023]圖2為低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMffF)對下肢動脈閉塞的外周血管病大鼠足底溫度的影響。
[0024]圖3為LMffF減輕下肢動脈閉塞的外周血管病大鼠腓腸肌的病理改變圖(X100);其中，A:正常對照組;B:模型組;C:褐藻多糖硫酸酯組;D:西洛他唑組。
[0025]圖4為LMffF減輕下肢動脈閉塞的外周血管病大鼠主動脈血管病理改變圖(X400);其中，A:正常對照組;B:模型組;C:褐藻多糖硫酸酯組;D:西洛他唑組
[0026]圖5為手術后Day28評價MRA，觀察側枝循環(huán)的建立和血管新生密度。
【具體實施方式】
[0027]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0028]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029]下述實施例中所用的褐藻多糖硫酸酯為低分子量褐藻多糖硫酸酯(LMffF)，其按照下述方法制備得到:
[0030]I)提取褐藻多糖硫酸酯:
[0031]取海帶粉碎后添加蒸餾水，沸水提取，提取液以硅藻土助濾過濾，濾液先以自來水流水透析一天，然后以蒸餾水透析一天，將透析液濃縮，向濃縮液中加乙醇至終濃度為75%沉淀，干燥沉淀，得粗褐藻多糖硫酸酯(簡稱粗品)。將粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl2存在下20%乙醇沉淀除去水溶性褐藻膠，濾液透析、濃縮后75%乙醇沉淀，干燥后即得純化的褐藻多糖硫酸酯。經(jīng)分析，海帶褐藻多糖硫酸酯主要由巖藻糖、半乳糖組成的硫酸多糖，其中巖藻糖含量為31%，硫酸基含量為32%，重均分子量180KD。
[0032]2)制備低分子量褐藻多糖硫酸酯:
[0033]取上述海帶褐藻多糖硫酸酯50g配成質量濃度為1.5%的水溶液，在該溶液中加入終濃度為30mM的抗壞血酸和終濃度為30mM的過氧化氫，常溫反應2小時。將該反應液用截留分子量為3600Da的透析袋依次在自來水和蒸餾水透析，之后濃縮，凍干，得到低分子量褐藻多糖硫酸酯樣品。對其進行化學分析結果表明巖藻糖含量為30%，測定方法參照下述文獻:[K.A.G.Michel Dubois,J.K.Hamilton,P.A.Rebers,Fred Smith,Colorimetric methodfor determinat1n of sugars and related substances,Analytical Chemistry28(1956)350-357)，硫酸基含量為31%，測定方法參照下述文獻:(Y.Kawai，N.Seno，K.Anno,Amodified method for chondrosulfatase assay,Analytical B1chemistry32(1969)314-321.]o
[0034]3)分子量測定
[0035]分析條件:ShiamdzuLC-20AT HPLC，TSK G3000PWxl色譜柱，流動相2.84%Na2S04溶液，流速lml/min，檢測器:示差檢測器RID 10A。結果:Mn:5765(number-average，數(shù)均)；1^:7102(￥6丨81^-3￥6作86，重均)，]\^/]\111:1.23。重均分子量為3-301(0范圍內(nèi)的其它低分子量褐藻多糖硫酸酯，可通過調節(jié)上述步驟2)降解反應體系中抗壞血酸和過氧化氫的摩爾比獲得。
[0036]實施例1、褐藻多糖硫酸酯在制備預防和/或治療下肢外周動脈血管病的產(chǎn)品中的應用
[0037]材料與方法
[0038]1、實驗動物的分組、給藥與造模:
[0039]實驗選取300?330g的Wistar大鼠，適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分組。實驗分為模型組(生理鹽水，灌胃)，藥物治療組(LMffF，100mg/kg，灌胃)，陽性藥組(西洛他唑，25mg/kg，灌胃)。外周血管病(PAD)模型前兩天給藥，記為Day(-2)。月桂酸鈉注射致外周動脈血栓栓塞模型在手術前五天給藥，記為Day (-5)。
[0040]2、外周血管病(PAD)手術造模:
[0041 ]用6 %水合氯醛，按0.006ml/kg劑量麻醉大鼠，碘伏擦拭手術部位，用刀片備皮，從大鼠腹股溝中點向膝蓋方向做長約2.5cm的切口，棉簽浸潤PBS后，鈍性剝離股動脈周圍的脂肪組織和肌肉組織，彎鑷和棉簽配合鈍性分離股動脈。從腹股溝韌帶下，借助股動脈的分支，用彎鑷牽拉出髂外動脈(以觀察到雙分支的髂內(nèi)動脈為標志)，雙線雙節(jié)扎;股動脈遠端分支為股深動脈和膚淺動脈，在此分叉處，雙線雙結扎;用電凝筆去除兩個結扎點中間的動脈及其分支，造成下肢動脈嚴重閉塞的外周血管病模型。用4-0縫合線縫合，青霉素肌肉注射3天，預防感染。
[0042]3、月桂酸鈉注射致外周動脈血栓栓塞模型:
[0043]禁食12h，6 %水合氯醛(0.006ml/g)麻醉。從大鼠腹股溝中點向膝蓋方向做長約
2.5cm的切口，棉簽浸潤PBS后，鈍性剝離股動脈周圍的脂肪組織和肌肉組織，彎鑷和棉簽配合鈍性分離股動脈，近心端用動脈夾阻斷血流，向遠心端注入0.1mL月桂酸鈉溶液(5g/L)，醫(yī)用蛋白膠封閉穿刺點，脫脂棉球按壓止血，15min后檢查無活動性出血即用4-0縫合線縫合皮膚。術后給予青霉素40萬單位/天，前肢肌肉注射三天預防感染。
[0044]4、測大鼠足底血流和溫度:
[0045]用10%水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠麻醉后以仰臥位放置在加熱板上，加熱板溫度設定為37°C以保證受試動物體溫的恒定，將探頭(Probe407-1，光纖距離0.22mm，Perimed，Sweden)插在探頭座上通過生物膠粘貼在大鼠下肢足底表面第一肉墊和第五肉墊連線的中點，平衡10分鐘，皮膚血流通過單點激光多普勒血流儀測定(Single-point laser Dopplerflowmetry,LDF,Periflux System 5000,780nm laser d1de，Perimed，Sweden)記錄3分鐘。激光多普勒血流儀檢測的血流量是紅細胞的數(shù)量乘以其平均速度的值，單位是自定義的arbitrary units(AU)。測完血流，再測加壓阻斷后反應性充血情況(PORH)，觀察足底血流的變化曲線。用紅外線溫度計測定足底溫度，測定位置同血流儀探頭放置位置(第I，5肉墊的連線中點)左右肢足底交替測量，每只鼠記錄5次結果。
[0046]5、磁共振血管造影(magnetic resonance ang1graphy，MRA):
[0047]大鼠稱重，尾靜脈注射造影劑釓雙胺注射液(0.2ml/kg)。接通氣麻裝置，腹臥位放于磁共振固定板上，進行磁共振血管造影。磁共振血管造影的參數(shù)設置:血管造影實驗包含二維時間飛躍法梯度回波序列，此方法利用了梯度場施加于全部三個方向而產(chǎn)生的流動補償，脈沖序列重復時間和回波時間分別為28毫秒和4.5毫秒，扳轉角為76°;捕獲了層厚為
0.55mm的150軸向切割碎片。矩陣尺度200 X 256，分辨率0.49 X 0.49m2。平均值為2且總數(shù)據(jù)采集時間為18min。造影完，取出動物，等蘇醒后放入籠內(nèi)。
[0048]6、HE染色和膠原染色
[0049]HE染色:取4%甲醛液固定的心室組織，按常規(guī)石蠟切片過程進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，7μπι厚度切片。石蠟切片用二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、HARRIS蘇木精染色、0.5 %鹽酸分色、0.5 % -1 %氨水快速藍化、0.5 %伊紅水溶液染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，37°C，24h烘片。顯微鏡下觀察，細胞核被蘇木精(帶陽離子，呈堿性)染成紫藍色，多數(shù)細胞質及非細胞成分被伊紅(帶陰離子，呈酸性)染成粉紅色。每組選3只大鼠左心室做石錯切片。
[0050]7、統(tǒng)計學方法
[0051]采用SPSS統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標準差(X±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
[0052]實驗結果:
[0053]1、LMWF對下肢動脈閉塞的外周血管病大鼠足底血流的影響
[0054]首先，觀察了LMWF對下肢動脈閉塞的外周血管病大鼠足底血流的影響。如圖1所示，Day(_2)給藥，DayO造模，造模后，缺血肢血流明顯減少。通過多普