一種負(fù)載Au納米顆粒的γ-PGA水凝膠中的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于水凝膠的制備領(lǐng)域，特別涉及一種負(fù)載Au納米顆粒的γ -PGA水凝膠中的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)成像由于其高空間分辨率、深層穿透能力、簡(jiǎn)便的圖像后處理技術(shù)和較低成本等特點(diǎn)，已經(jīng)成為了臨床上應(yīng)用最廣泛的診斷檢測(cè)技術(shù)之一。為了獲得更高分辨率的CT圖像，CT成像造影劑應(yīng)運(yùn)而生。目前臨床上常用的CT成像造影劑主要為含碘(I)造影劑，如碘海醇(1hexol)，碘普胺(1promide)，碘帕醇(1pamidol)等。但是此類造影劑成像效率不是很高，因此為了獲得更好的成像效果往往需要大劑量注射，故而對(duì)腎臟副作用也較明顯。因此為了獲得更好的CT成像效果，需要開發(fā)新型CT造影劑。金(Au)納米顆粒作為一種新型的CT成像造影劑，在CT成像方面具有傳統(tǒng)造影劑無可比擬的優(yōu)勢(shì)。Au的原子序數(shù)更高，X射線衰減系數(shù)更大，故而可以減少Au納米顆粒造影劑的使用量來獲得相同的成像效果。此外，Au的化學(xué)惰性在人體內(nèi)不會(huì)釋放有毒離子，使Au納米顆粒造影劑在CT成像造影劑方面具有更獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
[0003]近年來納米技術(shù)的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了Au納米顆粒在CT成像造影劑方面的發(fā)展，制備出的Au納米顆粒具有形貌尺寸可控、表面易修飾等特點(diǎn)。前期研究采用硼氫化鈉(NaBH4)還原法制備聚乙烯亞胺(PEI)穩(wěn)定的Au納米顆粒的結(jié)果表明，通過還原法制備的Au納米顆粒尺寸較小，粒徑較為均勻，并且表現(xiàn)出較好的X射線衰減性能，且其表面存在大量的氨基活性基團(tuán)，可以作為修飾位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的修飾(一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺包裹金納米顆粒的制備方法。中國(guó)發(fā)明專利，公開號(hào):CN104288788A，公開日期:2015.01.21)。
[0004]在諸多納米顆粒的修飾方法中，納米水凝膠具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。相比于單個(gè)納米顆粒，納米凝膠具有良好的膠體穩(wěn)定性，生物相容性、高負(fù)載能力、易于合成、尺寸可控、易于多功能化等特點(diǎn)。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一種天然多聚氨基酸，具有優(yōu)良的水溶性和生物相容性，是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料，目前已廣泛應(yīng)用于納米水凝膠的制備。根據(jù)之前報(bào)道的納米水凝膠具有更好的柔性和流動(dòng)性易被腫瘤細(xì)胞吞噬的特點(diǎn)，以及納米顆粒形成團(tuán)簇結(jié)構(gòu)可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)增強(qiáng)材料的X射線衰減能力的優(yōu)勢(shì)。
[0005]檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，尚沒有關(guān)于以NaBH4還原法合成的PEI穩(wěn)定的Au納米顆粒為交聯(lián)劑制備γ -PGA水凝膠作為CT成像造影劑研究的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種負(fù)載Au納米顆粒的γ-PGA水凝膠中的制備方法，該方法工藝簡(jiǎn)單，易于操作分離，原料來源廣泛;制備的γ -PGA納米水凝膠能穩(wěn)定地分散于水溶液中，粒徑分布均勻，X射線衰減性能較高、造影效果顯著，具有良好的醫(yī)用前景。
[0007]本發(fā)明的一種負(fù)載Au納米顆粒的γ-PGA水凝膠中的制備方法，包括:
[0008](I)將PEI的DMSO溶液加入到經(jīng)過1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽EDC和N-羥基琥珀酰亞胺NHS活化的羧甲基化甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH的二甲基亞砜DMSO溶液中，攪拌2-5天，透析，凍干，得到PEI.NH2-mPEG粉末;其中，mPEG_C00H、和PEI的質(zhì)量比為240:100;
[0009](2)將氯金酸HAuCl4溶液加入到步驟(I)中的PEI.NH2_mPEG的超純水溶液中，攪拌
0.5h，然后加入冰浴處理的NaBH4水溶液，繼續(xù)攪拌l_2h，透析，凍干，得到(Aut3)2OO-PEI.NH21PEG納米顆粒粉末;其中，PEI.NH2_mPEG、HAuCl4和NaBH4的質(zhì)量為 100:127:58.2；
[0010](3)向經(jīng)過EDC和NHS活化的γ -PGA超純水溶液中加入NaHCO3反應(yīng)0.5h，以降低PEI表面氨基與γ -PGA表面羧基的靜電作用;將反應(yīng)結(jié)束后的溶液加入到溶有磺基琥珀酸二辛酯鈉AOT的二氯甲烷DCM溶液中，攪拌1min，形成W/0乳液;然后將W/0乳液逐滴加入到PVA的超純水溶液中，攪拌15min，形成W/0/W的聚合物乳液;其中，γ -PGA與NaHCO3的質(zhì)量比為1:1.3； γ -PGA超純水溶液、AOT的DCM溶液和PVA超純水溶液的體積比為1:2:15;
[0011 ] (4)將步驟(2)中(Auq)2qq-PEI.NH2IPEG的超純水溶液逐滴加入到步驟(3)的W/0/W的聚合物乳液中，攪拌，除去有機(jī)溶劑，離心洗滌，得到Y(jié)-PGAzT(Aut3)2(X)-PEI.NH2_mPEG]，即負(fù)載Au納米顆粒的γ -PGA水凝膠;其中，γ -PGA和(Auq)2qq-PEI.NH2IPEG的質(zhì)量比為1:1.67ο
[0012]所述步驟(I)中EDC和NHS活化為:加入EDC攪拌l_2h;然后加入NHS繼續(xù)攪拌I_2h;mPEG_C00H、EDC 和 NHS 的質(zhì)量比為 240: 230: 140。
[0013]所述步驟(I)和步驟(2)中透析為截留分子量8000-14000的透析袋用蒸餾水透析3天。
[0014]所述步驟(2)HAuCU溶液加入到PEI.NH2_mPEG的超純水溶液后，攪拌的時(shí)間為
0.5h0
[0015]所述步驟(2)中PEI.NH2-mPEG的超純水溶液的濃度為lmg/mL。
[0016]所述步驟⑶中EDC和NHS活化為:加入EDC攪拌l-2h;然后加入NHS繼續(xù)攪拌l-2h;γ -PGA、EDC和NHS的質(zhì)量比為20mg: 30mg: 34mg。
[0017]所述步驟(3)中γ -PGA超純水溶液的濃度為lmg/mL; AOT的DCM溶液的濃度為33.5mg/mL ； PVA的超純水溶液的濃度為20mg/mL。
[0018]所述步驟(4)中攪拌的時(shí)間為12h。
[0019]所述步驟(4)中除去有機(jī)溶劑采用蒸發(fā)的方式。
[°02°] 所述步驟(4)中洗滌為:用超純水離心洗滌三次(6000rpm，1min)。
[0021]所述步驟(4)中負(fù)載Au納米顆粒的γ-PGA水凝膠應(yīng)用于CT成像造影劑。
[0022]本發(fā)明所制備的負(fù)載Au納米顆粒的γ -PGA納米水凝膠是由γ -PGA與(Auq)2οο_PEI.NH2-mPEG的靜電相互作用和化學(xué)作用交聯(lián)而成。本發(fā)明先利用NaBH4還原法合成PEI穩(wěn)定的Au納米顆粒，然后將其加入到經(jīng)EDC活化和雙乳化的γ -PGA溶液中，發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成負(fù)載Au納米顆粒的γ-PGA納米水凝膠。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，易于分離，原料來源廣泛。制備的γ-PGA納米水凝膠粒徑分布均勻，X射線衰減性能較好、造影效果顯著，具有良好的水溶性、膠體穩(wěn)定性和細(xì)胞相容性，易于被腫瘤細(xì)胞吞噬。腫瘤成像結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的負(fù)載Au納米顆粒的γ -PGA納米水凝膠具有顯著的造影效果，在CT成像造影劑領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[0023]本發(fā)明以NaBH4還原法合成的PEI穩(wěn)定的Au納米顆粒為交聯(lián)劑合成γ -PGA納米水凝膠，構(gòu)建了負(fù)載Au納米顆粒的γ -PGA水凝膠用作CT成像造影劑，其表面豐富的羧基可以進(jìn)一步修飾功能化試劑，為本發(fā)明的進(jìn)一步深入研究開發(fā)提供了很大的空間。
[0024]本發(fā)明使用Zeta電勢(shì)及動(dòng)態(tài)光散射分析(DLS)、紫外吸收光譜分析(UV-Vis)、Χ射線衍射分析(XRD)、傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜分析(FTIR)、熱重分析(TGA)、透射電子顯微鏡(TEM)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-OES)和X射線衰減性能等手段表征制備的負(fù)載Au納米顆粒的γ -PGA納米水凝膠。然后利用MTT細(xì)胞活力來評(píng)價(jià)納米水凝膠的細(xì)胞毒性，并用相差顯微鏡獲取與材料共培養(yǎng)后的細(xì)胞的形貌;隨后評(píng)價(jià)了腫瘤細(xì)胞對(duì)該納米水凝膠的吞噬能力。最后進(jìn)行體外細(xì)胞、裸鼠體內(nèi)腫瘤模型的CT成像實(shí)驗(yàn)，考察γ-PGA/[(Au0)2OO-PEI.NH2-mPEG]納米水凝膠的體內(nèi)外CT成像效果。
[0025]有益效果
[0026](I)本發(fā)明采用還原法合成的(Aut^QQ-PEI.NH2-mPEG納米顆粒作為交聯(lián)劑制備y-PGA/[(AuQ)2(K)-PEI.勵(lì)-mPEG]納米水凝膠用于CT成像造影劑，該方法工藝簡(jiǎn)單，易于操作分離，原料來源廣泛價(jià)廉，生物可降解，具有良好的發(fā)展前景；
[0027](2)本發(fā)明制備的y-PGA/[ (Auq)2qq-PEI.NHrmPEG]納米水凝膠粒徑分布均勻，具有良好的水溶性、膠體穩(wěn)定性和細(xì)胞相容性，對(duì)生物體無不良影響;X射線衰減性能好，造影效果顯著，該納米水凝膠表面擁有大量的活性基團(tuán)可用于進(jìn)一步的修飾和深入開發(fā)，在CT成像診斷領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0028]圖1為實(shí)施例2中γ -PGA/[(Au0)2OO-PEI.NH2IPEG]納米水凝膠水溶液在不同儲(chǔ)存時(shí)間的水動(dòng)力學(xué)直徑變化；
[0029]圖2為實(shí)施例2中γ -PGA/[(Au0)2OO-PEI.NH2-mPEG]納米水凝膠和(Auq)2QQ-PEI.NH2-mPEG納米顆粒的UV-Vi s圖譜；
[0030]圖3為實(shí)施例2中γ -PGA/[(Au0)2OO-PEI.NH2_mPEG]納米水凝膠和(Auq)2QQ-PEI.NH2-mPEG納米顆粒的XRD圖譜；
[0031]圖4 為實(shí)施例2 中 γ-PGA/T (Auq)2QQ-PEI.NH2-mPEG]納米水凝膠、(Auq)2QQ-PEI.NH2-mPEG納米顆粒和γ -PGA的FTIR圖譜；
[0032]圖5為實(shí)施例2中γ -PGA/[(Au0)2OO-PEI.NH2-mPEG]納米水凝膠和(Auq)2QQ-PEI.NH2IPEG納米顆粒的TGA分析