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      治療下肢缺血性疾病的藥物的制作方法_4

      文檔序號(hào):9917561閱讀:來源:國知局
      esearch Communications 449(2014)319-326)。種小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12于6孔板中,每孔 30萬細(xì)胞,18小時(shí)后,細(xì)胞換成不含抗生素的培養(yǎng)基(DMEM basic+10%胎牛血清(FBS))。同 時(shí)按照Lipof ectamine2000( Invitrogen)試劑的指導(dǎo)說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。2yg質(zhì)粒(shPHD3_l、 shPHD3-2shRNA表達(dá)質(zhì)粒)分別與200yL的0?丨丨-1^1培養(yǎng)基混合均勻,另外取441^ Lipofectamine2000與200yL的Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻。室溫靜置5min。將兩個(gè)混合體系 混合在一起,靜置20min后加入六孔板中。6h后換DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)(DMEM+ 10%胎牛血清(FBS)+penici 11 in-streptomycin solution),20h后更換培養(yǎng)基并在低氧環(huán) 境下培養(yǎng)12h,之后收集樣品進(jìn)行總RNA提取。
      [0128] RNA干擾試驗(yàn)中使用的干擾用序列如下所示:
      [0131 ] 低氧環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng):低氧處理是將細(xì)胞培養(yǎng)板和AnaeroPack . Anaero (Mitshubishi Gas Chemical ,Japan)放入專用密封容器(標(biāo)準(zhǔn)四角形密封容器, Mitsubishi Gas Chemical)內(nèi),放入培養(yǎng)箱。所述密封容器內(nèi)的氧氣濃度低于0.1%。
      [0132] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖3C。
      [0133] 由圖 3C可知,使PHD3基因沉默后,VEGF-A、ANGl、FGF2、PDGF-BB、HO-I、HGF、NF-κΒ 的 表達(dá)量均顯著上調(diào)。
      [0134] 2-3成熟血管形成的深入研究
      [0135] 申請(qǐng)人在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,繼續(xù)進(jìn)行了深入研究。為了確認(rèn)所形成的成熟血管 中的細(xì)胞的來源,申請(qǐng)人進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
      [0136] 2-3-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所用的紅景天苷的制備
      [0137] 將紅景天苷(上海同田生物技術(shù)有限公司,純度2 98.0%)用PBS溶解,配成2mg/ml 的儲(chǔ)存液,用〇. 22μηι濾膜過濾后,于-20°C保存。
      [0138] 2-3-1細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)
      [0139] 使用骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)
      [0140] 將骨骼肌細(xì)胞C2C12種在transwel 1小室內(nèi),每個(gè)小室內(nèi)種4000細(xì)胞,5小時(shí)后將盛 放transwell小室的24孔板內(nèi)分別換成對(duì)照培養(yǎng)基(含有10 %胎牛血清和Peni ci 11 in、 Streptomyc in的雙抗DMEM培養(yǎng)基)或含有紅景天苷的(在上述對(duì)照培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加紅 景天苷,紅景天苷含量是lOOμg/ml ),置于低氧條件下培養(yǎng)。18小時(shí)后取出transwell小室, 去除transwell小室內(nèi)部未迀移的細(xì)胞后,用DAP I染色透過濾膜而到達(dá)小室另一側(cè)的細(xì)胞 并在熒光顯微鏡下拍照(每組6張以上),并通過數(shù)6張照片中的細(xì)胞數(shù)(即迀移的細(xì)胞)得出 每張照片中細(xì)胞數(shù)的平均。
      [0141] 使用血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)
      [0142] 除了將細(xì)胞由小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12變更為小鼠血管平滑肌細(xì)胞MOVAS外,與上述 "使用骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)"同樣進(jìn)行。
      [0143] 將實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖4。
      [0144] 由圖4可知,紅景天苷顯著促進(jìn)了骨骼肌細(xì)胞的迀移,但對(duì)血管平滑肌細(xì)胞則沒有 促進(jìn)迀移的作用。
      [0145] 2-3-3條件培養(yǎng)基對(duì)于血管平滑肌迀移的作用
      [0146] 條件培養(yǎng)基處理組
      [0147] 首先將小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12播種到100mm*20mm培養(yǎng)皿內(nèi),每個(gè)板子60萬細(xì)胞,培 養(yǎng)18小時(shí)后用PBS清洗,并更換為含有紅景天苷的培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+Penicillin+ Streptomycin+100μg/ml紅景天苷),來刺激骨豁肌細(xì)胞。處理24小時(shí)后,去除含紅景天苷的 培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞,換上DMEM+10 %FBS+Penici 11 in+Streptomycin培養(yǎng)基后放入低氧 盒內(nèi)培養(yǎng)24h,收集培養(yǎng)基,3000rpm/min離心5min,收集上清液,用0.22μηι膜濾器進(jìn)行過濾。 將所收集的不含紅景天苷的培養(yǎng)基作為條件培養(yǎng)基。用條件培養(yǎng)基(該條件培養(yǎng)基里包含 了由骨骼肌細(xì)胞受到紅景天苷的刺激而分泌的多種分泌性蛋白)按照2-3-2里所述的方法 對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞MOVAS進(jìn)行Transwe 11小室實(shí)驗(yàn)。
      [0148] 對(duì)照組
      [0149] 與條件培養(yǎng)基的制作方法相同,但不添加紅景天苷,而是添加與紅景天苷同等體 積的PBS。用所獲得的對(duì)照培養(yǎng)基(該對(duì)照培養(yǎng)基里包含了由骨骼肌細(xì)胞在未受到的刺激的 情況下分泌的分泌性蛋白)按照2-3-2里所述的方法對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞MOVAS進(jìn)行 Transwell小室實(shí)驗(yàn)。
      [0150] 將條件培養(yǎng)基處理和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖5。
      [0151] 圖5表明,經(jīng)紅景天苷刺激的骨骼肌細(xì)胞所分泌的分泌性蛋白質(zhì)能夠促進(jìn)血管平 滑肌細(xì)胞的迀移。結(jié)合上述含紅景天苷的培養(yǎng)基對(duì)于血管平滑肌細(xì)胞的迀移沒有促進(jìn)作用 的結(jié)果,我們認(rèn)為,本實(shí)驗(yàn)中,血管平滑肌細(xì)胞的迀移之所以受到促進(jìn),是由于骨骼肌細(xì)胞 受到紅景天苷刺激后將分泌性蛋白分泌到培養(yǎng)基中,該分泌性蛋白起到了骨骼肌細(xì)胞-血 管平滑肌細(xì)胞間的細(xì)胞通訊的作用,從而實(shí)現(xiàn)的。另外已知的是,血管平滑肌細(xì)胞的迀移對(duì) 形成功能性的成熟血管非常重要。
      [0152] 2-3-4分泌性蛋白的確認(rèn)
      [0153] 利用上述的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞MOVAS,并在MOVAS的培養(yǎng)基里添加各 個(gè)血管新生因子受體的抑制劑,對(duì)小鼠血管平滑肌細(xì)胞MOVAS的迀移情況進(jìn)行確認(rèn)。
      [0154] 結(jié)果示于圖6。
      [0155] 由圖6可知,紅景天苷通過促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞的由FGF2和TOGF-BB 介導(dǎo)的細(xì)胞通訊促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的迀移,從而促進(jìn)成熟血管的形成。
      [0156] 2-3-5紅景天苷對(duì)于低氧下的骨骼肌細(xì)胞的凋亡的影響
      [0157] 凱基細(xì)胞凋亡PI染色試劑盒。貨號(hào):KGA214
      [0158] 將小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12種于6cm板中,每板種細(xì)胞10萬,18小時(shí)后用PBS清洗,并 更換為含有紅景天苷的培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+Penicillin+Streptomycin+100μg/ml紅景 天苷)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后去除培養(yǎng)基并用PBS清洗,換成不含紅景天苷的培養(yǎng)基后在低氧 條件下培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞后用細(xì)胞凋亡PI染色試劑盒(凱基,貨號(hào):KGA214)和流式細(xì)胞 儀(FACS)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。具體步驟如下:
      [0159] (1)用IxBuffer A洗滌細(xì)胞一次(離心2000rpm,5min),收集細(xì)胞并將細(xì)胞濃度稀 釋到lxlO6細(xì)胞/ml。
      [0160] (2)細(xì)胞加9倍體積的70 %乙醇,在-20 °C固定12-14小時(shí)。
      [0161] (3)離心收集細(xì)胞后用IxBuffer A洗滌細(xì)胞除去乙醇,細(xì)胞重懸于500yL Buffer 八中。
      [0162] (4)加入RNase A,使其終濃度為0.25mg/ml,37°C反應(yīng)30min。
      [0163] (5)加入5yL PI,室溫避光染色30min,然后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI陽性細(xì)胞(凋亡 細(xì)胞)。
      [0164] 發(fā)明人通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI陽性細(xì)胞數(shù)確認(rèn),低氧條件并未明顯誘導(dǎo)骨骼肌細(xì) 胞的凋亡,低氧條件下使用紅景天苷的凋亡率與常氧條件下和低氧對(duì)照的凋亡率無顯著差 異。
      [0165] 結(jié)果示于圖7。
      [0166] 2-3-6紅景天苷調(diào)控血管新生的機(jī)理的推測(cè)。
      [0167] 通過上述各個(gè)實(shí)驗(yàn),可以合理推測(cè),紅景天苷通過特異性抑制骨骼肌細(xì)胞中的 PHD3的表達(dá),從而促進(jìn)了骨骼肌細(xì)胞在低氧條件下的多種血管新生因子的表達(dá),還提高了 骨骼肌細(xì)胞自身的迀移能力,這些因素使得骨骼肌細(xì)胞分泌出的血管新生因子增多,受其 影響的范圍增廣;并且這些骨骼肌細(xì)胞分泌出的血管新生因子中的PDGF-BB和FGF2通過作 用于血管平滑肌細(xì)胞上的各自的受體(本發(fā)明中也稱為骨骼肌細(xì)胞-血管平滑肌細(xì)胞間的 細(xì)胞通訊)而促進(jìn)了對(duì)成熟血管形成起至關(guān)重要的作用的血管平滑肌細(xì)胞的迀移,最終實(shí) 現(xiàn)了成熟血管的形成,從而獲得了良好的下肢缺血性疾病的治療效果。
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1. 一種PHD3的特異性抑制劑,所述抑制劑為紅景天苷。2. -種血管新生因子的表達(dá)和分泌的促進(jìn)劑,所述促進(jìn)劑為紅景天苷。3. -種治療下肢缺血性疾病的藥物,所述藥物含有權(quán)利要求1的PHD3的特異性抑制劑 或權(quán)利要求2的促進(jìn)劑。4. 一種治療下肢缺血性疾病的藥物,所述藥物含有紅景天苷作為活性成分。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4的治療下肢缺血性疾病的藥物,所述藥物進(jìn)一步含有藥用輔料。6. -種血管平滑肌細(xì)胞迀移的促進(jìn)劑,所述促進(jìn)劑含有利用紅景天苷刺激骨骼肌細(xì)胞 而產(chǎn)生的分泌性蛋白。7. -種骨骼肌細(xì)胞迀移的促進(jìn)劑,所述促進(jìn)劑為紅景天苷。8. 紅景天苷在制備治療下肢缺血性疾病的藥物中的用途。9. 紅景天苷在制備PHD3的特異性抑制劑中的用途。10. 紅景天苷在制備血管新生因子的表達(dá)和分泌的促進(jìn)劑中的用途。
      【專利摘要】本發(fā)明提供一種治療下肢缺血性疾病的藥物,該藥物含有紅景天苷作為活性成分。此外,提供一種PHD3的特異性抑制劑,該抑制劑為紅景天苷。
      【IPC分類】A61P9/10, A61K31/7032
      【公開號(hào)】CN105687216
      【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610039248
      【發(fā)明人】吳壽榮, 江崎慧, 張靜
      【申請(qǐng)人】重慶大學(xué)
      【公開日】2016年6月22日
      【申請(qǐng)日】2016年1月21日
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