br>[0028]本發(fā)明的一種脂肪干細(xì)胞組合物的制備方法，其按質(zhì)量比計(jì)，將以下組分進(jìn)行混合均勻:
脂肪干細(xì)胞 10?50%;
水凝膠50?90%。
[0029]如圖1所示，本發(fā)明中，第一，首先在采集脂肪干細(xì)胞(具體可以在體外分離獲取患者自體的脂肪干細(xì)胞，而采用自體脂肪干細(xì)胞移植對(duì)人體幾乎不產(chǎn)生副作用，安全性高，克服了藥物治療副作用巨大，安全性低的缺點(diǎn))。其次，初步分離到了脂肪干細(xì)胞之后，必須要對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行體外大規(guī)模擴(kuò)增，以便達(dá)到足夠數(shù)量的細(xì)胞用以治療關(guān)節(jié)炎。第三，細(xì)胞擴(kuò)增好之后，消化細(xì)胞，清洗細(xì)胞，然后與事先準(zhǔn)備好的水凝膠在室溫下混合均勻。最后在進(jìn)行治療時(shí)，可將混合均勻的脂肪細(xì)胞及水凝膠混合液通過(guò)注射器注射到關(guān)節(jié)炎部位。所述的水凝膠為可注射溫度敏感型水凝膠。該水凝膠在體內(nèi)可降解，具體地，水凝膠和脂肪干細(xì)胞混合之后，在室溫下呈現(xiàn)出液態(tài)，當(dāng)混合物注射到關(guān)節(jié)炎部位后，在體內(nèi)37攝氏度條件下凝固成凝膠態(tài)。在需要向關(guān)節(jié)炎部位注射脂肪干細(xì)胞組合物時(shí)，注射干細(xì)胞數(shù)量為I億個(gè)細(xì)胞。
[0030]本發(fā)明的脂肪干細(xì)胞組合物所能治療的關(guān)節(jié)炎包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎及感染性關(guān)節(jié)炎等類型。
[0031]其中的脂肪干細(xì)胞為脂肪組織來(lái)源的一種具有多分化潛能的干細(xì)胞，具有能夠分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的能力。所述的脂肪干細(xì)胞可以從全身多處提取，包括臀部脂肪組織、皮下脂肪組織、腿部脂肪組織、目艮袋脂肪組織、腹部脂肪組織以及其他地方的脂肪組織。所述的脂肪干細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)條件下，使用顯微鏡觀察單個(gè)細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)梭型，在低倍顯微鏡下觀察細(xì)胞聚集呈現(xiàn)發(fā)散漩渦狀。
[0032]所述的脂肪干細(xì)胞表面表達(dá)CD29、CD44、⑶90以及⑶105等分子標(biāo)記物，不表達(dá)⑶34以及⑶133等分子。
[0033]所述的脂肪干細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)大規(guī)模擴(kuò)增，通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)以及流式細(xì)胞術(shù)來(lái)鑒定擴(kuò)增之后的脂肪干細(xì)胞，其中，能夠被脂肪干細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)志物⑶29、CD44、⑶90以及⑶105染色，同時(shí)不能夠被陰性分子標(biāo)志物⑶34以及⑶133等染色。脂肪干細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)大規(guī)模擴(kuò)增，通過(guò)三系分化實(shí)驗(yàn)即分化成脂肪細(xì)胞、軟管細(xì)胞以及骨細(xì)胞，并能夠鑒定為具有多分化潛能。
[0034]鑒定過(guò)程如下:
脂肪干細(xì)胞成脂分化過(guò)程:
a)首先配制分化培養(yǎng)基A組分包括:基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清，青霉素鏈霉素，谷氨酰胺，胰島素，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，羅格列酮，地塞米松；分化培養(yǎng)基B組分包括:基礎(chǔ)培養(yǎng)基，胎牛血清，青霉素鏈霉素，谷氨酰胺以及胰島素，將各自培養(yǎng)基的組分混合均勻，放4°C冰箱避光保存?zhèn)溆?。至?br> b)在六孔板中接種105個(gè)細(xì)胞/孔，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。
[0035]c)待細(xì)胞長(zhǎng)到100%匯合度后，吸去舊的培養(yǎng)基，每孔加入1.5 ml分化培養(yǎng)基A。
[0036]d)三天后吸去分化培養(yǎng)基A，每孔加入1.5 ml分化培養(yǎng)基B。
[0037]e)24小時(shí)后，吸去分化培養(yǎng)基B，每孔加入1.5 ml分化培養(yǎng)基A。
[0038]f)輪換加入分化培養(yǎng)基A和B，重復(fù)d-e步驟4次。
[0039]g)最后加入分化培養(yǎng)基B培養(yǎng)7天(中間需換液一次分化培養(yǎng)基B)。
[0040]h)誘導(dǎo)結(jié)束之后，吸去培養(yǎng)基，向每孔中加入I ml的4%多聚甲醛固定30分鐘。
[0041]i)用PBS洗2遍。
[0042]j)向每孔中加入I ml油紅O染色液，染色30分鐘。
[0043]k)用PBS洗3遍，然后置于倒置顯微鏡下觀察拍照。
[0044]成骨分化過(guò)程:
a)首先配制分化培養(yǎng)基，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基，胎牛血清，青霉素鏈霉素，谷氨酰胺，抗壞血酸，甘油磷酸以及地塞米松混合均勻，放4 0C冰箱避光保存?zhèn)溆谩?br>[0045]b)將六孔板用0.1%的明膠預(yù)處理(接種細(xì)胞前至少提前30分鐘用明膠處理，或者加入明膠之后把六孔板用封口膜封上，放4 °C冰箱備用。
[0046]c)六孔板在使用前吸去多余明膠液體，然后在1%明膠預(yù)處理的六孔板中接種適量細(xì)胞(5 X 104個(gè)細(xì)胞/孔)。
[0047]d)在37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
[0048]e)24小時(shí)后吸去培養(yǎng)基，換上成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(1.5 ml/孔)。
[0049]f)每3天換一次成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)2-3周。
[0050]g)誘導(dǎo)結(jié)束之后，吸去培養(yǎng)基，向每孔中加入I ml的4%多聚甲醛固定30分鐘。
[0051 ] h)用PBS洗2遍。
[0052]i)向每孔中加入I ml茜素紅S染色液，染色5-10分鐘。
[0053]j)用PBS洗3遍，然后置于倒置顯微鏡下觀察拍照。
[0054]成軟骨分化過(guò)程:
a)首先配制成軟骨分化培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基，地塞米松，抗壞血酸，胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸添加物，丙酮酸鈉，脯氨酸以及TGF-03混合均勻，放4 °C冰箱避光保存?zhèn)溆谩?br>[0055]b)將六孔板用明膠預(yù)處理。
[0056]c)六孔板在使用前吸去多余明膠液體，然后在1%明膠預(yù)處理的六孔板中接種適量細(xì)胞(5 X 104個(gè)細(xì)胞/孔)。
[0057]d)加入成軟骨分化培養(yǎng)基，2-3天換一次液。
[0058]e)細(xì)胞分化3周后，吸去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定30分鐘。
[0059]f)用PBS洗2遍。
[0060]g)向每孔中加入I ml阿利新藍(lán)染色液，染色30分鐘。
[0061]h)用PBS洗3遍，然后置于倒置顯微鏡下觀察拍照。
實(shí)施例
[0062]1.脂肪干細(xì)胞與可注射溫敏性水凝膠混合
本實(shí)施例流程主要是首先在體外分離獲取患者自體的脂肪干細(xì)胞，而采用自體脂肪干細(xì)胞移植對(duì)人體幾乎不產(chǎn)生副作用，安全性高，克服了藥物治療副作用巨大，安全性低的缺點(diǎn)。其次，初步分離到了脂肪干細(xì)胞之后，必須要對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行體外大規(guī)模擴(kuò)增(具體為:首先接種適量細(xì)胞在10厘米培養(yǎng)板中，然后每個(gè)培養(yǎng)板加入1ml培養(yǎng)基，其后在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)-72小時(shí)，如60小時(shí))，以便達(dá)到足夠數(shù)量的細(xì)胞用以治療關(guān)節(jié)炎。第三，細(xì)胞擴(kuò)增好之后，消化細(xì)胞，清洗細(xì)胞(具體為:首先吸去培養(yǎng)基，然后加入1ml的磷酸鹽緩沖液清洗一遍，之后加入Iml胰蛋白酶消化液消化3-5分鐘，如4分鐘。消化完畢之后，加入1ml含有FBS的完全培養(yǎng)基中和消化，之后吸取細(xì)胞至15ml離心管，用1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。離心完成之后，去除上清液，再向離心管中加入5ml磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，其后用用1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集細(xì)胞)，然后與事先準(zhǔn)備好的水凝膠在室溫下混合。最后，將混合均勻的細(xì)胞及水凝膠混合液通過(guò)注射器注射到關(guān)節(jié)炎部位，如圖1所示。
[0063]2.擴(kuò)增之后的脂肪干細(xì)胞可用表面分子標(biāo)志物及三系分化實(shí)驗(yàn)鑒定
由于需要用到脂肪干細(xì)胞作為治療物，因此，在初步分離了脂肪干細(xì)胞之后以及脂肪干細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增之后均需要進(jìn)行脂肪干細(xì)胞的鑒定，如圖2所示。鑒定分離到的細(xì)胞是脂肪干細(xì)胞具有細(xì)胞表面分子標(biāo)志的熒光免疫技術(shù)鑒定，還需要有細(xì)胞分化鑒定。脂肪干細(xì)胞表面分子標(biāo)記物有CD29、CD44、CD90以及CD105，同時(shí)，脂肪干細(xì)胞表面不表達(dá)CD34和⑶133，因此，免疫熒光染色能夠在顯微鏡下觀察到表達(dá)⑶29、⑶44、⑶90以及⑶105，而⑶34和CD133染色則觀察不到熒光。除此之外，為了證明分離的細(xì)胞是脂肪干細(xì)胞，還必須要證明其具有多分化潛能，即能夠分化成其他終末分化的細(xì)胞，比如脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞等，稱為三系分化實(shí)驗(yàn)。
[0064]3.脂肪干細(xì)胞可以與基于殼聚糖-β_甘油磷酸鈉可注射溫敏性水凝膠結(jié)合注射本實(shí)施例需要用水凝膠作為脂肪干細(xì)胞的載體，其中，脂肪干細(xì)胞可以和基于殼聚糖-