一種經(jīng)血源干細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種經(jīng)血源干細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢早衰是指女性在40周歲以前，除妊娠外，由某種原因?qū)е碌拈]經(jīng)，以血清雌激 素水平下降、促性腺激素水平升高為特征的疾病。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)提示，女性40歲以前的發(fā) 病率為1 %，原發(fā)性必經(jīng)中卵巢早衰占 I〇 %~28 %，繼發(fā)性閉經(jīng)中卵巢早衰占4%~18 %，且 發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。卵巢早衰已成為當(dāng)今婦女不孕癥的主要病因之一，嚴(yán)重影響患 者生活質(zhì)量、增加社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。對于卵巢早衰的病因及發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，尚不十分清 楚。卵巢早衰的治療主要采用激素治療，但是有臨床研究發(fā)現(xiàn)，以激素治療卵巢早衰會增加 乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌以及心血管疾患、中風(fēng)的發(fā)病率。
[0003] 近年來間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療成為臨床研究的熱點(diǎn)，為卵巢早衰的臨床治療提供 新的希望，并取得初步的療效。目前雖然已有用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療 卵巢早衰的報(bào)道，并取得一定的療效，但是需要經(jīng)過骨穿刺才能獲取骨髓，對機(jī)體造成較大 的身體創(chuàng)傷，同時(shí)骨髓含有復(fù)雜的細(xì)胞成分，干細(xì)胞在其中的含量較低，需要較長時(shí)間的擴(kuò) 增，并不是比較好的種子細(xì)胞;臍帶干細(xì)胞雖然免疫原性低，但是如果早期沒有儲存間充質(zhì) 干細(xì)胞，只能采用異體干細(xì)胞移植，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 近年來，日本科學(xué)家在女性經(jīng)血中發(fā)現(xiàn)了具有多向分化潛能的干細(xì)胞，該干細(xì)胞 可用于修復(fù)受損的心肌組織。2008年，美國科學(xué)家Patel等發(fā)現(xiàn)，從健康女性經(jīng)血中可分離 出來間充質(zhì)干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有多向分化能力，并將該細(xì)胞命名為經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細(xì) 胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells ,MenSCs) aMenSCs屬于成體干細(xì) 胞的一種，具有來源豐富、有效成分含量豐富、收集過程無創(chuàng)、增殖和分化潛能巨大、無倫理 爭論及廢物回收利用等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，研究表明，宮內(nèi)膜干細(xì)胞可以用于治療卵巢早衰、子宮 內(nèi)膜疾病、預(yù)防衰老等功能，有望成為較為理想的種子細(xì)胞。但目前并未見關(guān)于經(jīng)血源干細(xì) 胞制劑的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種經(jīng)血源干細(xì)胞制劑及其制備方 法與應(yīng)用，本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑干細(xì)胞存活率高，性質(zhì)穩(wěn)定，對卵巢早衰的治療 效果良好。
[0006] 本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑包括:經(jīng)血源干細(xì)胞、白蛋白和生理鹽水。
[0007] 生理鹽水是指生理學(xué)實(shí)驗(yàn)或臨床上常用的滲透壓與動物或人體血漿的滲透壓相 等的氯化鈉溶液。本發(fā)明采用的生理鹽水是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉溶液，其與人體組 織的滲透壓一致，以其作為溶劑，不會對經(jīng)血源干細(xì)胞產(chǎn)生損傷。
[0008]白蛋白（又稱清蛋白，albumin，Alb)是血衆(zhòng)中含量最多的蛋白質(zhì)，占血衆(zhòng)總蛋白的 40%~60%。能夠維持血漿膠體滲透壓的恒定且承擔(dān)一定的運(yùn)輸功能。以往的研究中表明， 白蛋白可能會誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化。但本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在經(jīng)血源干細(xì)胞制劑中添加白 蛋白可以為經(jīng)血源干細(xì)胞提供營養(yǎng)，提高經(jīng)血源干細(xì)胞在制劑中的存活率，且經(jīng)血源干細(xì) 胞制劑在低溫保藏一個(gè)月后仍未見分化的跡象。
[0009] 在一些實(shí)施例中，其中所述白蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%~5%。
[0010] 在一些實(shí)施例中，其中所述白蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%。
[0011] 在一些實(shí)施例中，其中所述白蛋白為人血清白蛋白。
[0012] 在一定范圍內(nèi)，白蛋白的添加量與經(jīng)血源干細(xì)胞的存活率成正相關(guān)。但過高的白 蛋白濃度會導(dǎo)致細(xì)胞因滲透壓失衡而失水變形，反而降低經(jīng)血源干細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)表 明，制劑中添加白蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %~5%最有利于提尚細(xì)胞存活率。
[0013] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，其中所述經(jīng)血源干細(xì)胞的密度為1〇4個(gè)/mL~IO5個(gè)/mL。
[0014] 在一些實(shí)施例中，其中所述經(jīng)血源干細(xì)胞的密度為IO4個(gè)/mL。
[0015] 在一些實(shí)施例中，其中所述經(jīng)血源干細(xì)胞的密度為IO5個(gè)/mL。
[0016] 制劑中，干細(xì)胞密度過大則存活率會因營養(yǎng)不足而大幅降低，而干細(xì)胞密度過小 也不利于存活率的保持，且過小的干細(xì)胞密度會導(dǎo)致用所需制劑量的增大。本發(fā)明通過實(shí) 驗(yàn)證實(shí)，干細(xì)胞密度為IO 4個(gè)/mL~IO5個(gè)/mL時(shí)，干細(xì)胞存活率最高。
[0017] 在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)血源干細(xì)胞的制備方法包括：
[0018] 步驟1:以PBS稀釋經(jīng)血后，分離單個(gè)核細(xì)胞，以PBS清洗后，接種至無血清培養(yǎng)基； [0019] 步驟2:37°C，體積分?jǐn)?shù)為5%的⑶2，培養(yǎng)48h后，半量換液，72h后全量換液，之后每 3天全量換液1次，直至細(xì)胞生長至70 %~80 %匯合，傳代。
[0020] 在一些實(shí)施例中，無血清培養(yǎng)基為Lonza無血清培養(yǎng)基。
[0021] 經(jīng)血源干細(xì)胞分離自女性經(jīng)血，來源豐富，且屬于廢物利用，很好的解決了臍帶干 細(xì)胞或其他干細(xì)胞存在的倫理問題。經(jīng)血源干細(xì)胞的分離方法對其細(xì)胞活性的影響很大， 本申請采用的制備方法能夠最大限度的保護(hù)經(jīng)血源干細(xì)胞的活性。
[0022] 作為優(yōu)選，PBS稀釋經(jīng)血時(shí)，PBS與經(jīng)血的體積比為1:1。
[0023] 作為優(yōu)選，F(xiàn)icoll分離液與經(jīng)血的體積比為1:1。
[0024]作為優(yōu)選，單個(gè)核細(xì)胞的分離方式為離心分離，具體為，700g離心15min后，轉(zhuǎn)移上 清液，以PBS清洗2次后，再次離心取細(xì)胞沉淀，接種至無血清培養(yǎng)基。
[0025] 作為優(yōu)選，接種的密度為7 X IO5CelΙ/mL~8 X 105cel 1/mL。
[0026] 作為優(yōu)選，傳代具體為：以胰蛋白酶消化后，懸浮細(xì)胞接種于無血清培養(yǎng)基，繼續(xù) 培養(yǎng)。
[0027] 在一些實(shí)施例中，經(jīng)血源干細(xì)胞為為第3代~第5代的經(jīng)血源干細(xì)胞。
[0028] 第3代~第5代的經(jīng)血源干細(xì)胞能夠保持干細(xì)胞固有的分化潛能，不會出細(xì)胞凋亡 或衰退的現(xiàn)象，其狀態(tài)最佳，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以迅速增長并分化。
[0029]本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑的制備方法，包括:將白蛋白與生理鹽水混合后， 重懸經(jīng)血源干細(xì)胞，獲得經(jīng)血源干細(xì)胞制劑。
[0030]本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑能夠很好的維持經(jīng)血源干細(xì)胞的活性和存活率， 在保存期間不會發(fā)生分化，因此，本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑可以用于制備治療卵巢 早衰的藥物。
[0031]本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑在制備治療卵巢早衰的藥物中的應(yīng)用。
[0032]在一些實(shí)施例中，經(jīng)血源干細(xì)胞制劑治療卵巢早衰的劑量為0.2mL/次~0.4mL/ 次。
[0033]在一些實(shí)施例中，經(jīng)血源干細(xì)胞制劑治療卵巢早衰的方法為注射，具體為0.2mL/ 次~0.4mL/次，注射的次數(shù)為2次，每日一次。
[0034] 本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑，包括:經(jīng)血源干細(xì)胞、白蛋白和生理鹽水。本發(fā) 明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑中，經(jīng)血源干細(xì)胞在白蛋白及生理鹽水的保護(hù)下，能夠維持良 好的存活率和活性，且不會啟動分化。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑能夠?qū)⒔?jīng) 血源干細(xì)胞的存活率維持在99%以上，細(xì)胞大小均勻、形態(tài)均為梭型。(TC~4°C保存1個(gè)月 后，細(xì)胞仍保持著良好的形態(tài)，沒有出現(xiàn)體積變大等異常現(xiàn)象，存活率仍保持在95%以上， 且經(jīng)表面抗原檢測，經(jīng)血源干細(xì)胞仍保持干細(xì)胞的特點(diǎn)，沒有發(fā)生分化，具有良好的活性。 以本申請?zhí)峁┑慕?jīng)血源干細(xì)胞制劑用于治療卵巢早衰能夠具有良好的治療效果，使用本發(fā) 明提供的經(jīng)血源干細(xì)胞制劑一周后，小鼠卵泡數(shù)量顯著(P〈〇.05)增加。
【附圖說明】
[0035]圖1示原代培養(yǎng)7天的經(jīng)血源干細(xì)胞，40 X ;
[0036] 圖2示原代培養(yǎng)7天的經(jīng)血源干細(xì)胞，100X。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 本發(fā)明提供了一種經(jīng)血源干細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通 過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文的 方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0038] 本發(fā)明采用的材料、儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0039] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0040] 實(shí)施例1
[0041] 取經(jīng)檢驗(yàn)合格的經(jīng)血，用相同體積的PBS溶液稀釋經(jīng)血形成經(jīng)血稀釋液;取隔層離 心管，加入經(jīng)血稀釋液一半體積的F i c 〇 11分離液，緩慢加入經(jīng)血稀釋液，之后7 0 0 g離心 15min;將上層溶液移至另一個(gè)新的離心管中，PBS清洗2遍，用無血清培養(yǎng)基重懸離心后沉 淀，調(diào)整接種密度為7~8X 105/ml，接種至培養(yǎng)皿中，十字混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱中培