白，步驟如下：
[0174] (1)谷胱甘肽樹脂預(yù)裝柱的平衡:使用30ml的緩沖液A(PBS+2mMEDTA)進(jìn)行層析柱 平衡，控制流速為3mL/min左右。
[0175] (2)融合蛋白與層析柱的結(jié)合:將澄清的細(xì)胞粗提物上樣，控制流速為l-2mL/min 左右。
[0176] (3)融合蛋白的洗脫:待曲線下降平穩(wěn)后用緩沖液B (roS+2mMEDTA+20mM谷胱甘肽） 將目的蛋白洗脫，控制流速為lml/min，收集洗脫峰。
[0177] (4)濃縮蛋白：用超濾管濃縮洗脫液，過脫鹽柱，純水洗脫，控制流速為3mL/min，取 洗脫峰溶液，真空冷凍干燥后，取部分溶解進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。鑒定結(jié)果如圖1所示。 [0178]實(shí)施例2(-種氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的蛋白質(zhì)制備方法）
[0179] 1)取重組大腸桿菌E.coli DH5a pGEX-4T-AIP2培養(yǎng)，至培養(yǎng)液0D600nm為0.6時(shí)加 入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.8mM，而后于35°C、震蕩條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4h;
[0180] 2)收集菌體，將菌體重懸于PBS緩沖液后，在冰浴條件下超聲破碎20次(每次破碎 的持續(xù)時(shí)間為2s，每2次破碎之間的間隔時(shí)間為4s )，而后收集上清；
[0181 ] 3)取緩沖液A，以2.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽瓊脂糖樹脂柱;取步驟2)上清液， 以lmL/min的流速上樣;取緩沖液B，以0.8mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰處溶液即為洗脫 液;取洗脫液超濾濃縮，而后過脫鹽柱，再利用純水以2.5mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰處 溶液即為第二洗脫液，而后冷凍干燥，即得到所述蛋白質(zhì)；
[0182] 其中所述緩沖液A是含有1.5mM EDTA的PBS緩沖液；
[0183] 所述緩沖液B是含有1.5mM EDTA、15mM谷胱甘肽的PBS緩沖液。
[0184]實(shí)施例3(-種氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的蛋白質(zhì)制備方法）
[0185] 1)取重組大腸桿菌E.coli DH5a pGEX-4T-AIP2培養(yǎng)，至培養(yǎng)液0D600nm為0.9時(shí)加 入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.2mM，而后于39°C、震蕩條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)5h;
[0186] 2)收集菌體、破碎、收集上清；
[0187] 3)取緩沖液A，以3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽瓊脂糖樹脂柱;取步驟2)上清液， 以2mL/min的流速上樣;取緩沖液B，以1.2mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰處溶液即為洗脫 液;取洗脫液超濾濃縮，而后過脫鹽柱，再利用純水以3.5mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰處 溶液即為第二洗脫液，而后冷凍干燥，即得到所述蛋白質(zhì)；
[0188] 其中所述緩沖液A是含有2.5mM EDTA的PBS緩沖液；
[0189] 所述緩沖液B是含有2.5mM EDTA、25mM谷胱甘肽的PBS緩沖液。
[0190]實(shí)施例4(一種氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的蛋白質(zhì)制備方法）
[0191] 1)取重組大腸桿菌E.coli DH5a pGEX-4T-AIP2培養(yǎng)，至培養(yǎng)液0D600nm為0.7時(shí)加 入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.9mM，而后于37°C、震蕩條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4.5h;
[0192] 2)收集菌體，將菌體重懸于PBS緩沖液后，在冰浴條件下超聲破碎30次(每次破碎 的持續(xù)時(shí)間為4s，每2次破碎之間的間隔時(shí)間為6s )，而后收集上清；
[0193] 3)取步驟2)上清液，利用GST親和層析純化，收集洗脫液后超濾濃縮，脫鹽，干燥， 即得到所述蛋白質(zhì)。
[0194] 實(shí)施例5(實(shí)施例2所制備蛋白分別對(duì)單核增生李斯特菌、大腸桿菌0157 : H7、鼠傷 寒沙門氏菌的氨芐青霉素敏感性影響實(shí)驗(yàn)）
[0195] 單核增生李斯特菌、大腸桿菌0157: H7和鼠傷寒沙門氏菌均與長(zhǎng)雙歧桿菌特異性 蛋白AIP2共培養(yǎng)2h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)后分別將三種致病菌等量轉(zhuǎn)接到加入不同濃度氨芐的等 體積LB液體培養(yǎng)基，對(duì)黏附蛋白處理組和GST處理組進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)對(duì)比。具體方法如下：
[0196] (1)用無菌PBS溶液將黏附蛋白AIP2分別稀釋至濃度均為45yg/mL，GST作為對(duì)照稀 釋至相同濃度，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0197] (2)單核增生李斯特菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，8000r/min，4°C條件下離心5min后，收集 菌體，無菌PBS洗滌3次，分別用GST稀釋液、黏附蛋白AIP2稀釋液重懸菌體，稀釋至細(xì)菌濃度 均為IO6CFUAiL，于37 °C細(xì)菌培養(yǎng)震蕩器處理2h。
[0198] (3)分別等量接種黏附蛋白處理過和GST處理的單核增生李斯特菌、大腸桿菌 0157:H7和鼠傷寒沙門氏菌于2mL加入不同濃度的氨芐LB液體培養(yǎng)基，氨芐濃度梯度為50， 25，10，1，0.1以 8/1^，均于37°(：恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)611，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。
[0199] 如圖2所示，與對(duì)照組相比較，被粘附蛋白處理后的微生物在抗生素的作用下抑菌 效果更為明顯，由于抗生素〇點(diǎn)處對(duì)照組與粘附蛋白處理組的生物量水平相當(dāng)，因此可以認(rèn) 為粘附蛋白本身并不具有直接的抑菌效果，而僅起到抗生素抑菌增效作用。
[0200] 實(shí)施例6(實(shí)施例2所制備蛋白分別對(duì)單核增生李斯特菌、大腸桿菌0157 : H7、鼠傷 寒沙門氏菌的青霉素 G敏感性、頭孢霉素敏感性、卡那霉素敏感性、氯霉素敏感性影響實(shí)驗(yàn)）
[0201] 單核增生李斯特菌、大腸桿菌0157: H7和鼠傷寒沙門氏菌均與長(zhǎng)雙歧桿菌特異性 蛋白AIP2共培養(yǎng)2h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)后分別將三種致病菌等量轉(zhuǎn)接到加入不同濃度氨芐的等 體積LB液體培養(yǎng)基，對(duì)黏附蛋白處理組和GST處理組進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)對(duì)比。具體方法如下： [0202] (1)用無菌PBS溶液將黏附蛋白AIP2分別稀釋至濃度均為55yg/mL，GST作為對(duì)照稀 釋至相同濃度，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0203] (2)單核增生李斯特菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，8000r/min，4°C條件下離心5min后，收集 菌體，無菌PBS洗滌3次，分別用GST稀釋液、黏附蛋白AIP2稀釋液重懸菌體，稀釋至細(xì)菌濃度 均為IO6CFUAiL，于37 °C細(xì)菌培養(yǎng)震蕩器處理2h。
[0204] (3)分別等量接種黏附蛋白處理過和GST處理的單核增生李斯特菌、大腸桿菌 0157: H7和鼠傷寒沙門氏菌于2mL加入濃度分別為lyg/mL青霉素 G、lyg/mL頭孢霉素、2yg/mL 卡那霉素或2yg/mL氯霉素的LB液體培養(yǎng)基，均于37°C恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，進(jìn)行活菌 計(jì)數(shù)。結(jié)果見圖3。
[0205] 如圖3所示，黏附蛋白處理后的微生物在抗生素作用下受到了更為突出的抑制，菌 體密度普遍為對(duì)照組的1/10以下，由此可見，本發(fā)明長(zhǎng)雙歧桿菌蛋白質(zhì)具有確切、顯著的抑 菌增效作用。
[0206] 以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例， 并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng) 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白質(zhì)用于提升單核增生李斯特菌對(duì)抗生素敏感 性的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗生素是β_內(nèi)酰胺類抗生素。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗生素是氨基糖苷類抗生素。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗生素是酰胺醇類抗生素。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征于所述應(yīng)用是利用含有濃度為45~55yg/mL的、 氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的蛋白質(zhì)溶液，以接觸方式處理單核增生李斯特菌。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來源于長(zhǎng)雙歧桿菌的粘附蛋白，并明確了其氨基酸序列；在此基礎(chǔ)上實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該粘附蛋白不僅能夠粘附于腸上皮細(xì)胞，而且具有提升微生物抗生素敏感性的作用，特別是對(duì)單核增生李斯特菌，這種抗生素增效作用尤為突出。基于這種有益的發(fā)現(xiàn)，確定了該蛋白作為單核增生李斯特菌抑菌增效劑的用途，從而擴(kuò)展了其用途范圍，同時(shí)提供了一種提升微生物藥敏性的新途徑。本發(fā)明基于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)手段獲得了突出的技術(shù)效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K38/16, A61K31/43, A61K45/06, A61K31/7036, A61P31/04
【公開號(hào)】CN105688186
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610108267
【發(fā)明人】徐鋒, 楊棟, 魏華, 武曉麗, 蔚曉敏, 吳姚平
【申請(qǐng)人】南昌大學(xué)
【公開日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2016年2月26日