使用辛德畢斯病毒載體和腫瘤相關抗原誘導抗腫瘤免疫的方法
【專利說明】使用辛德畢斯病毒載體和腫瘤相關抗原誘導抗腫瘤免疫的 方法
[0001 ]因為本發(fā)明受到美國國家癌癥研究所、國立衛(wèi)生研究院、及衛(wèi)生和公共事業(yè)部的 美國公共健康基金CA100687的資助，美國政府享有本發(fā)明的一定權利。
【背景技術】
[0002] 溶瘤病毒(Oncolytic VirUSeS，0V)是腫瘤細胞中特異性靶向和復制的病毒[1]。 由于它們的選擇性和溶瘤性，OV作為常規(guī)癌癥治療的備選或補充已引起了極大的興趣[2]。 然而，OV療法的主要限制是在腫瘤部位不適當?shù)膹椭坪驮鲋砙3,4]。此外，出于安全性原因， 許多OV被設計成復制缺陷型以防止其擴散至健康組織，這進一步限制了它們的溶瘤潛能
[5]。
[0003] 對此問題的一種可行的解決方案是補充具有旁觀者效應(bystander effect)的 直接病毒溶瘤作用，其中不直接被OV感染的腫瘤細胞也將被摧毀。這例如可通過將治療性 或細胞毒性基因插入OV基因組而遞送至腫瘤部位來實現(xiàn)[6,7]。賦有天然免疫原性，某些OV 能夠有效刺激免疫系統(tǒng)，提高使用OV誘導免疫學抗癌旁觀者效應的可能性[8]。這種既得的 觀點進一步推動了可由0V(0V/TAA)遞送至腫瘤部位[12]的各種臨床相關的腫瘤相關抗原 (TAA)的鑒定[9,10]和近期的優(yōu)化[11]。在其自然狀態(tài)下，TAA通常免疫原性低下[13]。然 而，通過將抗病毒免疫應答重定向到TAA，免疫原性0V/TAA能夠潛在地打破這種免疫耐受 性。因此，OV研究的主要目標應當為開發(fā)安全有效的0V/TAA試劑。辛德畢斯病毒（Sindbis virus，SV)為含正單鏈RNA基因組的甲病毒屬[14]，代表選定數(shù)量的已展示出既作為0V[15， 16]也作為病毒疫苗[17]的特殊潛能的病毒之一。之前已示出復制缺陷型SV載體靶向并抑 制小鼠中異種移植、同系和自發(fā)的腫瘤的生長[16，18]。
[0004] 近來，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SV誘導荷瘤小鼠中自然殺傷(natural killer，NK)細胞和巨噬 細胞的活化[19]。另外，表達免疫調芐基因如白細胞介素12(IL-12)的SV載體具有提高的抗 腫瘤[16]和免疫刺激[19]作用。然而，這些方法通常還未導致完全的腫瘤緩解（tumor remission) [19]。此外，某些腫瘤細胞可能不被SV有效祀向[20]，強調了對于開發(fā)增強SV抗 癌療法的新途徑的需求。
[0005] 之前，假設SV載體的使其成為有效的溶瘤劑和基因遞送系統(tǒng)的特質（如通過血流 傳播和遞送高水平異源蛋白[21]的能力)還能夠用于有效的TAA遞送。此外，SV生命周期的 特征在于缺少DNA相，使載體更加安全，還涉及高水平雙鏈RNA(dsRNA)(強烈的免疫學'危險 信號'）[22]、以及隨后的I型干擾素通路[23]的活化。安全性、免疫原性、有效傳播和高TAA 表達的組合使SV/TAA成為引人注目的0V/TAA的候選者。因此，本領域所需要的是使用SV/ TAA治療患有腫瘤的哺乳動物的方法，從而利用所有上文提到的益處。

【發(fā)明內容】

[0006] 本文公開的BALB/c CT26結腸癌腫瘤模型用于探究SV作為0V/TAA試劑的用途。發(fā) 現(xiàn)并不像其它試驗的腫瘤模型，CT26細胞在體內并不被SV靶向。然而，攜帶β半乳糖苷酶的 SV載體(SV/LacZ)在荷有表達LacZ的CT26腫瘤的小鼠中具有顯著的治療效力。使用活體成 像系統(tǒng)（in vivo imaging system, IVIS)用于焚光素酶活性的體內靈敏檢測[24]，縱膈淋 巴結(mediastinal lymph nodes，MLN)被識別為腹膜內（intraperitoneal，i ·ρ·)注射攜帶 螢火蟲熒光素酶基因的SV載體（SV/Fluc)之后早期瞬時異源蛋白表達的部位。TAA遞送至 MLN中標志著強烈免疫應答的起點，而該強免疫應答以顯示對LacZ陽性和陰性腫瘤細胞的 強細胞毒性的效應和記憶CD8+T細胞的產生為頂峰。后一種現(xiàn)象被稱為表位擴散(epitope spreading)，現(xiàn)已提議為患者中有效癌癥免疫療法的重要組分[25]。
[0007] -方面，本發(fā)明提供一種用于治療患有腫瘤的哺乳動物的方法，所述方法包括以 下步驟:鑒定由該腫瘤表達的腫瘤相關抗原(TAA)，并向該哺乳動物胃腸外給予治療有效量 的攜帶編碼TAA的基因的辛德畢斯病毒載體，使所述哺乳動物足以引起針對所述腫瘤的免 疫應答，從而治療所述腫瘤。
[0008] 另一方面，本發(fā)明提供一種在哺乳動物中誘導針對腫瘤的CD8+T-細胞介導的免疫 應答的方法，所述方法包括以下步驟:鑒定至少一種由該腫瘤表達的腫瘤相關抗原(TAA)， 和向需要此類治療的哺乳動物以有效引起針對腫瘤的CD8+T-細胞介導的免疫應答的量胃 腸外給予攜帶編碼TAA的基因的辛德畢斯病毒載體。
[0009] 根據(jù)本說明書、權利要求和附圖，本發(fā)明的這些及其它方面對于本領域普通技術 人員將是明顯的。
【附圖說明】
[0010] 圖Ia-Ic · SV/LacZ抑制表達LacZ的CT26 · CL25腫瘤的生長。（a)將0 · 5 X IO6的表達 LacZ的CT26.CL25(左圖）或LacZ陰性CT26.WT(右圖）細胞皮下（s.c.)注射到BALB/c小鼠的 右脅腹。腫瘤接種后第9天開始，用SV/LacZ、對照SV/Fluc載體或培養(yǎng)基(假處理(Mock))腹 膜內處理小鼠。測量腫瘤體積(mm 3)并繪圖（N=3-4)。數(shù)據(jù)代表至少兩次獨立的實驗。（b)腹 膜CT26 · CL25荷瘤小鼠的Kaplan-Meier存活圖。將2 · 5 X IO4的CT26 · CL25細胞腹膜內注射并 在第4天開始處理(N=S)t3SVAacZ和假處理組的數(shù)據(jù)代表2次獨立實驗。（c)示出經(jīng)SV/LacZ 和對照處理的CT26.CL25.Fluc肺荷瘤小鼠的代表性IVIS圖像(左圖）。相對腫瘤生長(右上 圖）通過將各個體小鼠的發(fā)光標準化至第一圖像(第2天)來測定，并對存活率作圖（右下圖） (N = 5-8)。數(shù)據(jù)代表至少兩次獨立的實驗。（a)和（c)中的數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM.*p〈 0 · 05**p〈0 · 01。SV，辛德畢斯病毒載體。
[0011] 圖2a-2c. TAA表達和T細胞活化在縱膈淋巴結中發(fā)生。（a)皮下CT26. CL25荷瘤小鼠 (左圖）或無瘤小鼠（右圖）用SV/Fluc.腹膜內處理。在第5次（左圖）或第1次(右圖）處理后3 小時，拍攝生物發(fā)光圖像來監(jiān)測來自載體的Fluc表達。為了確定上身信號的來源，提取MLN 并單獨成像(右圖）。左圖中的紅色圈表示各小鼠中皮下瘤的位置。（b)CT26.CL25.Fluc肺荷 瘤小鼠用SV/LacZ處理。24小時后，提取縱膈和腹股溝淋巴結并染色，以確定T細胞(CD3陽 性，MHC II類陰性)在淋巴結中的百分比。示出代表性圖（左圖）及其定量(右圖；11 = 3)。（(：） 分析在腹膜內SV/LacZ注射后24小時從肺荷瘤小鼠的縱膈和腹股溝淋巴結提取的CD8+T細 胞上CD69的表達。示出代表性流式細胞圖（左圖）、和示出CD69高的細胞的百分比的柱狀圖 (右圖；n = 3) Jb)和（c)中的數(shù)據(jù)代表兩次獨立的實驗（第二實驗在腹膜內荷瘤小鼠中完 成），并表示為平均值土 SEMjpW. 05#p〈0.01 Jluc，螢火蟲熒光素酶;MLN，縱膈淋巴結； ILN，腹股溝淋巴結;S/L，SV/LacZ(SV，辛德畢斯病毒載體）；TAA，腫瘤相關抗原。
[0012] 圖3a和3b. SV/LacZ誘導強烈的CD8+T細胞應答。（a)CT26. CL25 .Fluc肺荷瘤小鼠用 SV/LacZ或培養(yǎng)基(假處理)處理。7天后，分析腹膜細胞。示出代表性流式細胞圖（左圖）、和 CD8+T細胞計數(shù)（右圖）（平均值土ΒΕΜ,Νζβ)。^)使用NKG2D和L-選擇素（L-selectin)作為 活化標志物進一步分析來自腹膜和肺的CD8+T細胞以確定它們的活化狀態(tài)。示出代表性流 式細胞圖（左圖）和活化的(NKG2D高，L-選擇素低)細胞的計算百分比（右圖）（平均值土SEM， ~=3)。噸〈0.05*噸〈0.01。5￥，辛德畢斯病毒載體。
[0013] 圖4a_4d.SV/LacZ誘導LacZ-特異性CD8+T細胞應答。（a，b)SV/LacZ或假處理開始 后2周收集并分析來自CT26.CL25皮下荷瘤小鼠的脾細胞。示出代表性四聚物圖（a)、和四聚 物陽性細胞的百分比(13)0=5)。（幻治療開始后7天收集、染色并分析來自腹膜內和肺荷瘤 小鼠的腹腔的細胞0 = 4-5)。（(1)開始處理后7天分析來自肺荷瘤小鼠的肺，并分析在肺中 的LacZ四聚物陽性和陰性的CD8+T細胞亞群中活化的（NKG2D高，L-選擇素低）細胞的百分 比，并繪制為圖31^0 = 3)。（13)-((1)中的數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM.*p〈0.05#p〈0.01.SV，辛 德畢斯病毒載體。
[0014] 圖5a和5b.淋巴細胞在SV/LacZ治療期間獲得LacZ特異性細胞毒性。假處理（-)、 SV/GFP(G)或SV/LacZ(L)處理開始后7天從CT26.CL25.Fluc肺荷瘤小鼠提取肺淋巴細胞。所 提取的肺淋巴細胞與 CT26.CL25.Fluc 細胞（CT26.CL25)或 CT26.WT.Fluc 細胞（CT26.WT)共 培養(yǎng)2天，以確定(a)肺淋巴細胞對各腫瘤細胞群的細胞毒性，和(b)，對如材料和方法部分 記載的與各腫瘤細胞群的共培養(yǎng)作出應答的來自肺淋巴細胞的IFN-γ分泌（(a)和(b)中的 數(shù)據(jù)表示為平均值土30』=3)。*邙〈0.01(顯著不同于假處理）。10，未檢出。5￥，辛德畢斯 病毒載體。
[0015] 圖6a-6c.CD8+T細胞對于增強SV/LacZ治療效果是必要的。比較(a)皮下、（b)腹膜 內和(c)肺腫瘤模型中完整的和⑶8+T細胞去除（⑶8+T細胞(-))小鼠之間SV/LacZ的治療效 果。（a)在規(guī)定時間點測量CT26.CL25皮下腫瘤的大小并對各組作圖（N = S)Jb)監(jiān)測 CT26.CL25腹膜內荷瘤小鼠的存活率并繪制為Kaplan-Meier存活圖。N = 8-9(c)分析 CT26.CL25. Fluc肺荷瘤小鼠的腫瘤生長（左圖）和存活率（右圖）。如圖Ic定量相對腫瘤生 長，并以Kaplan-Meier存活圖示出存活率(N = 5)。（a)和(c)中的數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。* 卩〈0.05，*撲〈0.01。13，不顯著;3￥，辛德畢斯病毒載體。
[0016] 圖7a_7e .對內源CT26TAA的免疫在SV/LacZ治療期間發(fā)展。（a，b)假處理(-)、SV/ GFP(G)或SV/LacZ(L)處理開始后7天從CT26.CL25皮下荷瘤小鼠提取脾細胞。所提取的脾細 胞與 0'26.0^5.?111(3((^26.(^25)或(^26.11'上111(3((^26.11')細胞共培養(yǎng)2天，以確定(3)脾 細胞對各腫瘤細胞群的細胞毒性，和(b)對如材料和方法部分記載的與各腫瘤細胞群的共 培養(yǎng)作出應答的來自脾細胞的IFN-γ分泌(平均值±30少=3). (c)在SV/LacZ最終處理后 超過60天，將CT26. WT. Fluc腫瘤靜脈（i . V.)接種至無處理的(naiVe)和CT26. CL25SV/LacZ-處理的腫瘤-治愈小鼠，并通過生物發(fā)光成像在規(guī)定時間點分析肺中的腫瘤生長。左圖示出 2次獨立實驗的代表性IVIS圖像。右圖示出在規(guī)定時間點腫瘤生物發(fā)光的定量(平均值± SEM少=8)。（(1)在SV/LacZ最終處理后超過30天，CT26. WT. Fluc腫瘤靜脈接種至無處理的和 SV/LacZ-處理的腫瘤-治愈小鼠（S)。腫瘤接種后8天，從各小鼠提取脾細胞并用LacZ、gp70、 或對照肽培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，如材料和方法部分所記載的，分析IFN- γ分泌的LacZ-或gp70- 特異性誘導(平均值土 SEM，N = 3)。（ e)使用gp70四聚物通過流式細胞術定量(d)中提取的脾 細胞中gp70-特異性CD8+T細胞數(shù)(平均值土 30少=3)。噸〈0.05，*邙〈0.01(顯著不同于假處 理或無處理）。N. D，未檢出；SV，辛德畢斯病毒載體。
[0017] 圖8. SV/TAA治療期間CD8+T細胞活化的四步模型。步驟I: SV/LacZ的腹膜內注射導 致縱膈淋巴結中LacZ的瞬時免疫原性表達(深藍色箭頭），接著在該部位和/或備選的位置 誘導T細胞活化(淺藍色箭頭）。疆細胞也針對腫瘤細胞活化(褐色箭頭）。步驟2(紅色箭頭）： LacZ-特異性CD8+T細胞的細胞毒性導致腫瘤細胞被破壞，以及腫瘤相關抗原如LacZ和gp70 隨后釋放。步驟3(綠色箭頭）：抗原呈遞細胞捕獲這些抗原并將其呈遞至腫瘤引流淋巴結中 的⑶8+T細胞，導致表位擴散，包括可潛在地靶向LacZ(-)腫瘤細胞逃逸變體的gp70-特異性 ⑶8+T細胞的誘導。步驟4(紫色箭頭）：產生針對多種腫瘤相關抗原的記憶⑶8+T細胞。APCJA 原呈遞細胞;LN，淋巴結;MLN，縱膈淋巴結;NK，自然殺傷細胞；SV，辛德畢斯病毒載體;TAA， 腫瘤相關抗原;Tc，細胞毒性⑶8+T細胞;Tm，記憶⑶8+T細胞。<