用于癌癥治療的免疫刺激性hiv tat衍生多肽的制作方法
【專利說明】用于癌癥治療的免疫刺激性HIV TAT衍生多肽
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請基于35USC§119 (e)要求2013年10月4日提交的美國臨時專利專利申請61 / 887,166的權(quán)益，所述專利申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于癌癥的基于免疫的治療劑領(lǐng)域。
[0004] 罝量
[0005] 免疫檢查點(diǎn)代表導(dǎo)致對癌癥的有效免疫應(yīng)答被抑制的抑制性分子，其可導(dǎo)致腫瘤 逃逸。免疫檢查點(diǎn)分子例如細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA_4)和程序性細(xì)胞死亡l(ro-l) 以及程序性細(xì)胞死亡配體I(PD-Ll)被認(rèn)為促進(jìn)伴隨癌癥進(jìn)展的免疫功能紊亂且它們的治 療性阻斷已顯示出臨床益處。特別地，腫瘤ro-Li和ro-i參與浸潤細(xì)胞毒性τ淋巴細(xì)胞(CTL) 被認(rèn)為通過誘導(dǎo)T-細(xì)胞不應(yīng)、耗竭和程序性細(xì)胞死亡而成為腫瘤逃逸和免疫抵抗背后的重 要機(jī)制。理解免疫應(yīng)答期間免疫檢查點(diǎn)分子的操作是設(shè)計(jì)人類癌癥的有效免疫療法的重要 策略。
[0006] 人免疫缺陷病毒(HIV)轉(zhuǎn)錄反式激活因子(Tat)是可變的RNA結(jié)合肽，其提高病毒 RNA轉(zhuǎn)錄并且可以引起T4細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡，還可能刺激α干擾素的過量生產(chǎn)。然而，從 經(jīng)HIV感染的長期無進(jìn)展者(LTNP)中分離的Tat蛋白與在由于HIV感染已經(jīng)發(fā)展成獲得性免 疫缺陷綜合癥(AIDS)的患者中發(fā)現(xiàn)的Tat不同。在LTNP中發(fā)現(xiàn)的Tat蛋白能夠反式激活病毒 RNA;然而，這種免疫刺激性Tat不誘導(dǎo)T4細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的凋亡且無免疫抑制性。在感染猴 物種的慢病毒中發(fā)現(xiàn)的免疫刺激性Tat的變體也不導(dǎo)致免疫缺陷的發(fā)展且流行性感染指導(dǎo) 單核細(xì)胞分化為刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答的樹突細(xì)胞(DC)。因此，免疫刺激性 Tat可用于刺激對人類癌癥的免疫應(yīng)答。
[0007]癌癥和慢性感染是對基于免疫的治療應(yīng)答的常見人類疾病的最突出的例子。盡管 感染是要通過免疫來控制的首要疾病，但是人類中的臨床試驗(yàn)已經(jīng)確定了免疫應(yīng)答尤其是 免疫系統(tǒng)的CTL臂能夠使一些人類黑色素瘤和腎癌消退。這些觀察結(jié)果被下述發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展:一 類特別的抗原呈遞細(xì)胞(APC)DC特別有效地引起針對癌癥和其它疾病的CTL活性。靶向和激 活DC的技術(shù)已經(jīng)導(dǎo)致針對由人類乳頭狀瘤病毒(HPV)感染引起的人類宮頸前惡性腫瘤和人 類肺癌的一些早期成功。與目前針對癌癥使用的化學(xué)治療藥物相反，激發(fā)針對癌癥的CTL應(yīng) 答的藥劑由于免疫應(yīng)答的巨大特異性而伴隨著極少的副作用。
[0008]開發(fā)治療癌癥的免疫治療藥物的努力被下述技術(shù)困難阻礙:靶向和激活DC，從而 將所需的進(jìn)入信號遞送并維持至CTL。誘導(dǎo)CTL應(yīng)答的抗原靶向在下述范圍內(nèi)是一種挑戰(zhàn)： 天然加工需要抗原進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，從而結(jié)合免疫系統(tǒng)的主要組織相容性復(fù)合物(MHC) I 類抗原，這是CTL激活的必要條件，因?yàn)榧せ頒TL上T細(xì)胞受體的配體是抗原和MHC I類的復(fù) 合物。在幾乎所有情況下，蛋白質(zhì)抗原甚至在它們與DC輔助激活因子偶聯(lián)時排他地進(jìn)入取 代性的MHC II類抗原呈遞途徑，其排除CTL刺激。這可以部分通過基于肽的技術(shù)來克服，因 為肽結(jié)合已經(jīng)位于DC表面上的MHC I類。然而，該技術(shù)是非特異性的，并且大部分肽是差的 DC激活因子，這限制了它們作為人類癌癥治療的功效。
[0009] 已知有限的一組生物蛋白質(zhì)刺激CTL應(yīng)答。人免疫缺陷病毒I(HIV-I)轉(zhuǎn)錄反式激 活因子(Tat)的變體和衍生物能夠刺激該CTL應(yīng)答。目前已知直接引發(fā)CTL應(yīng)答的其它生物 品以熱休克蛋白（HSP)為基礎(chǔ)，或者以某些細(xì)菌的外殼蛋白為基礎(chǔ)。在與HPV感染相關(guān)的某 些生殖器瘤的治療中，熱休克蛋白顯示有限的功效。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本文公開了用作癌癥治療劑的人類免疫缺陷病毒(HIV)轉(zhuǎn)錄反式激活因子(Tat) 蛋白的衍生物。人工的免疫刺激性Tat衍生多肽具有治療癌癥的潛力。
[0012] 在一個實(shí)施方式中，提供了轉(zhuǎn)錄反式激活因子(Tat)衍生多肽，其具有氨基酸序 列，所述氨基酸序列以以下順序包含：（i)來自人類免疫缺陷病毒(HIV)或者猴免疫缺陷病 毒(SIV)Tat蛋白的轉(zhuǎn)錄因子(TF)結(jié)構(gòu)域序列，（ii)來自SIV、HIV或防御素(defensin)的富 半胱氨酸結(jié)構(gòu)域序列，和(i i i)來自HIV或SIV Tat蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域序列。
[0013] 本文還公開了包含本文所公開的Tat衍生多肽的藥物組合物。
[0014] 在Tat衍生多肽的一個實(shí)施方式中，HIV是HIV-I或HIV-2。在另一個實(shí)施方式中， HIV-ITat來自長期無進(jìn)展者。在另一個實(shí)施方式中，SIV來自選自表2的宿主。在另一個實(shí)施 方式中，防御素是α_防御素或β_防御素。在另一個實(shí)施方式中，Tat衍生多肽還包含來自 HIV-I或HIV-2Tat的富精氨酸結(jié)構(gòu)域。
[0015] 在Tat衍生多肽的另一個實(shí)施方式中，TF結(jié)構(gòu)域中至少一個氨基酸被缺失或者被 丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸或蘇氨酸取代。在另 一個實(shí)施方式中，至少一個被取代的氨基酸是脯氨酸。
[0016] 在某些實(shí)施方式中，TF結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NOs:96-123之一的氨基酸序列。在另一 些實(shí)施方式中，富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NOs :124-132之一的氨基酸序列。在另一些 實(shí)施方式中，C末端結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NOs:133-150之一的氨基酸序列。
[0017] 在另一個實(shí)施方式中，Tat衍生多肽與SEQ ID NOs 5-95之一的序列同一性高于 85%。在另一個實(shí)施方式中，Tat衍生多肽不是SEQ ID NOs:2、3或4之一。
[0018] 本文還公開了治療癌癥的方法，所述方法包括：向有此需要的受試者施用治療有 效量的本文所公開的Tat衍生多肽或藥物組合物;和在所述受試者中引起癌癥生長的停止 或癌癥的消退。
[0019] 本文還公開了治療有效量的Tat衍生多肽或藥物組合物治療有此需要的受試者中 的癌癥的用途，從而在所述受試者中引起癌癥生長的停止或癌癥的消退。
[0020] 本文還公開了降低患有癌癥的受試者中的腫瘤負(fù)荷的方法，所述方法包括：向有 此需要的受試者施用治療有效量的本文所公開的Tat衍生多肽或藥物組合物;和在所述受 試者中引起癌癥的消退。
[0021] 本文還公開了治療有效量的Tat衍生多肽或藥物組合物降低患有癌癥的受試者中 的腫瘤負(fù)荷的用途，從而在所述受試者中引起癌癥的消退。
[0022] 本文還公開了抑制患有癌癥的受試者中的抗腫瘤免疫應(yīng)答的阻抑的方法，所述方 法包括：向受試者施用治療有效量的本文所公開的Tat衍生多肽或藥物組合物;其中所述施 用在所述受試者中引起癌癥生長的降低或抑制或者癌癥的消退。
[0023] 本文還公開了治療有效量的Tat衍生多肽或藥物組合物抑制患有癌癥的受試者中 的抗腫瘤免疫應(yīng)答的阻抑的用途，其中Tat衍生多肽的施用在所述受試者中引起癌癥生長 的降低或抑制或者癌癥的消退。
[0024] 本文還公開了治療患有癌癥的受試者中的表達(dá)PD-Ll的腫瘤的方法，所述方法包 括:施用治療有效量的本文所公開的Tat衍生多肽或藥物組合物;其中所述施用在所述受試 者中引起癌癥生長的降低或抑制或者癌癥的消退。
[0025] 本文還公開了治療有效量的Tat衍生多肽或藥物組合物治療患有癌癥的受試者中 的表達(dá)H)-L1的腫瘤的用途，其中Tat衍生多肽的施用在所述受試者中引起癌癥生長的降低 或抑制或者癌癥的消退。
[0026]在所述方法或用途的一個實(shí)施方式中，Tat衍生多肽與SEQ ID NOs 5-95之一的序 列同一性高于85%。
[0027]在所述方法或用途的一個實(shí)施方式中，Tat衍生多肽以多劑施用。在所述方法或用 途的另一個實(shí)施方式中，施用包括重復(fù)性施用循環(huán)，其中每個循環(huán)包括在確定的時間段中 施用多劑的Tat衍生多肽，之后是休息期，并且其中所述循環(huán)被重復(fù)多次。在所述方法或用 途的另一個實(shí)施方式中，施用包括重復(fù)性施用循環(huán)，其中每個循環(huán)包括在確定的時間段中 施用多劑的Tat衍生多肽，之后在確定的時間段中施用單劑或多劑的治療劑，并且其中所 述循環(huán)被重復(fù)多次。在所述方法或用途的另一個實(shí)施方式中，治療劑是環(huán)磷酰胺。
[0028] 在所述方法或用途的另一個實(shí)施方式中，癌癥是腎上腺皮質(zhì)癌、肛門癌、闌尾癌、 星形細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌、膽道癌、膀胱癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、支氣管腺瘤/類癌、類癌瘤、 宮頸癌、慢性骨髓增殖性疾病、結(jié)腸癌、促纖維增生性小圓細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、 食道癌、尤因氏肉瘤、生殖細(xì)胞腫瘤、眼癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸道間質(zhì)瘤 (GIST)、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、胃類癌、頭頸癌、心臟癌、肝細(xì)胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽 癌、胰島細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、巨 球蛋白血癥、髓母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、默克細(xì)胞癌、間皮瘤、嘴癌、多發(fā)性骨髓瘤/漿細(xì)胞腫 瘤、蕈樣肉芽腫、鼻腔和鼻旁竇癌、鼻咽癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、口癌、口咽癌、卵巢癌、卵巢上皮 癌、胰腺癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、松果腺星形細(xì)胞瘤、松果腺生殖細(xì)胞 瘤、成松果腺細(xì)胞瘤、垂體腺瘤、胸膜肺母細(xì)胞瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌、視網(wǎng)膜母細(xì) 胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里(S6zary)綜合征、皮膚癌、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、睪 丸癌、喉癌、胸腺瘤、甲狀腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨 球蛋白血癥（Wa丨denstrommacroglobulinemia)或韋爾姆斯氏瘤。
[0029] 在所述方法或用途的另一個實(shí)施方式中，至少一種來自受試者的治療前腫瘤含有 至少5%的表達(dá)PD-Ll的細(xì)胞、5%-20%的表達(dá)I 3D-Ll的細(xì)胞、5%-15%的表達(dá)I3D-Ll的細(xì)胞 或5%-10%的表達(dá)I3D-Ll的細(xì)胞。 附圖簡介
[0030] 圖1描述了用Tat衍生物對人類單核細(xì)胞的刺激。
[0031] 圖2描述了用Tat衍生物刺激人類單核細(xì)胞的劑量應(yīng)答曲線。
[0032]圖3A和3B描述了Tat衍生物對4T1腫瘤體外生長的療效。在注射腫瘤細(xì)胞后第0、7、 14和21 天，用Nani-Pl或Nani-P2(400ng，皮下[SC])(圖3A)(圖3A)或Nani-P3(400ng或2yg， SC)(圖3B)處理注射了 I X IO4個4T1腫瘤細(xì)胞的BALB/c小鼠。對照組用I3BS處理。數(shù)據(jù)表示平 均腫瘤體積;棒土 SE。每組含有IO只小鼠。從第15天起，對照組和用Nani-P1或Nani-P2處理 的組之間的差異顯著(P〈〇.〇5#)。從第22天開始，對照和Nani-P2或Nani-P2之間的差異高 度顯著化〈0.01**)。他1^-?3(任一劑量)和對照之間無差異。
[0033]圖4描述了經(jīng)純化的Nani_P2對4T1乳腺腫瘤體內(nèi)生長影響的劑量應(yīng)答曲線。對每 組十只BALB/c小鼠的四個組植入IX IO4個4T1細(xì)胞。三個組經(jīng)21天在左側(cè)被分別給予每只 小鼠四次〇.4ng、4ng和40ng的遞增劑量。第四組對照組在左側(cè)注射PBS。數(shù)據(jù)表示平均腫瘤 體積。對照組和〇.4ng劑量之間的差異顯著(P〈0.5*)，對照組和4ng或40ng Nani-P2處理組 之間的差異高度顯著(ρ〈〇· 1**，ρ〈〇·〇1**)。
[0034] 圖5Α和5Β描述了用Nani-P2處理帶有4Τ1乳腺腫瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活曲 線。第0天在乳腺墊(mammary pad)中對小鼠 SC注射I X IO4個4T1細(xì)胞。第0天用SC施用的四 次劑量的Nani-P2(40ng)開始處理。第42天，處理組具有超過對照的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著更好的存活 (**)(圖5A)。在一組中，治療被延遲至第13天，此時一系列三次劑量的Nani-P2(40ng)被每 周靜脈內(nèi)（IV)施用、SC施用進(jìn)引流淋巴結(jié)中或瘤內(nèi)（IT)施用（圖5B)。第47天IV Nani-P2的 存活益處(survival benefit)是高度統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的（**)，同時SC Nani-P2的存活益處也是 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(*)。
[0035] 圖6A和6B描述了 TS/A和SMl乳腺癌模型中Nani-P2的抗腫瘤活性。對小鼠 SC植入1 \105個了3/^乳腺癌細(xì)胞（圖64)，并用遞增劑量的30似11卜?2(0.41^、41^和40即)處理。即 使在最低劑量時，原發(fā)性的抗癌差異也是高度顯著的（P〈〇. 01**)，同時40ng劑量也是高度 顯著的（P〈〇. 01#*)。圖6B描述了SC植入2 X IO5個SMl乳腺癌細(xì)胞并在第0、7、14和21天用 Nani-P2(40ng)SC處理的小鼠。對照和用Nani-P2處理的SMl動物之間的原發(fā)性腫瘤生長差 異是高度統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(P〈〇.01***)。
[0036]圖7描述了來自帶有4T1乳腺腫瘤的小鼠脾細(xì)胞的INF- γ生產(chǎn)。對BALB/c小鼠 SC注 射I X IO4個4T1細(xì)胞。對照動物每周接受PBS注射，而Nani-P2處理包括每周一次的SC注射 (40ng)，從第0天開始持續(xù)4周。第33天當(dāng)對照小鼠處于末期時，將小鼠處死，收獲脾并作為 單細(xì)胞懸浮液冷凍，直至測定時。將脾細(xì)胞(2 X IO5個)和I X IO4個絲裂霉素 C處理(50μg/ml， 30分鐘）的4T1刺激細(xì)胞(S)涂布在96孔平