一種紫花牡荊素肺靶向脂質體及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種紫花牡荊素肺靶向脂質體及其制備方法與應用，屬于肺癌藥物研 究領域。
【背景技術】
[0002] 肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，發(fā)達國家肺癌的5年生 存率約10%~15%，在我國則更低。肺癌患者中80%~85%為非小細胞肺癌，且多數患者初 次診斷時已處于晚期（mb/iv期），失去手術機會。放療和化療雖可在一定程度上改善肺癌 的整體治療水平，但效果并不理想。放療難以根除浸潤轉移的肺癌細胞，而化療無選擇性， 在殺傷癌細胞的同時也對正常細胞造成傷害。因此，尋找更為有效和安全的治療手段成為 當前肺癌研究的一個熱點。
[0003] 由于脂質體(liposomes)能夠保護藥物避免其在血漿中降解、繞開外排轉運蛋白， 利于藥物靶向入肺部，顯著增加肺部藥物濃度，從而提高治療效果并減小全身毒副作用，廣 泛用于肺部藥物傳遞的研究。轉鐵蛋白（transf errin，TF)是一類Π 型跨膜糖蛋白家族，由2 個單體(90 000)經二硫鍵交聯而成。轉鐵蛋白受體(1:瓜1181^1-^〇6卩1:〇1'1?1〇在分裂活躍 的細胞上表達水平很高，在腫瘤細胞上每個細胞能達到1萬~10萬個分子，而在非增殖細胞 上很少表達，甚至檢測不到。TF/TFR系統在轉運抗癌藥、蛋白質以及基因治療藥物上顯示出 了很大潛能。基于此，有望提供以中方肺靶向脂質體。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種紫花牡荊素肺靶向脂質體及其制備方法與應用，本法通 過將革G向肺癌的功能基配體TF (轉鐵蛋白）修飾到脂質體表面，增加脂質體到達肺部的能 力；同時，本發(fā)明將紫花牡荊素包載到靶向脂質體中，增強其對腫瘤細胞促凋亡作用，為殺 死腫瘤細胞提供可能，從而防止治療后因細胞殘留而引起腫瘤復發(fā)。
[0005] 本發(fā)明所提供的靶向脂質體，由脂質體和轉鐵蛋白組成；
[0006] 所述轉鐵蛋白連接于所述脂質體的羧基。
[0007] 上述的靶向脂質體中，所述脂質體的羧基可由二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG-C00H)提供。
[0008] 上述的靶向脂質體中，所述脂質體具體可由卵磷脂、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇（DSPE-PEG)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基（DSPE-PEG-⑶0H)制備 得到；
[0009] 各原料的摩爾份數可為：
[0010] 所述卵磷脂80~88份；
[0011] 所述膽固醇7~15份；
[0012] 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.2~4.8份；
[0013] 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.2~0.7份；
[0014] 各原料的摩爾份數具體可為：
[0015] 所述卵磷脂84份；
[0016] 所述膽固醇11份；
[0017]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4.5份；
[0018]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基0.5份。
[0019]所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇具體可為二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙 二醇2000(DSPE-PEG2000);
[0020] 所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基具體可為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚 乙二醇 2000-羧基交連物(DSPE-PEG2000-C00H)。
[0021] 上述的靶向脂質體中，所述轉鐵蛋白與所述脂質體的質量比可為1:8.1~9.1，具 體可為1:8.6。
[0022]本發(fā)明進一步提供了所述靶向脂質體的制備方法，包括如下步驟：在碳二亞胺 (EDCI)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)存在的條件下，所述轉鐵蛋白連接于所述脂質體的所述 羧基上，即得所述靶向脂質體。
[0023]上述的制備方法中，所述脂質體可由所述卵磷脂、所述膽固醇、所述二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺-聚乙二醇與所述二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基通過硫酸銨梯度法制備 得到。
[0024]上述的制備方法中，所述碳二亞胺與所述轉鐵蛋白的摩爾比為12~18:1，具體可 為16.5:1;
[0025] 所述N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為35~40:1，具體可為39.7:1。
[0026] 以所述靶向脂質體為活性成分的藥物載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0027] 本發(fā)明還提供一種載藥脂質體，其由所述靶向脂質體包載藥物得到。
[0028] 所述載藥脂質體中，所述藥物具體可為紫花牡荊素（Casticin，CAS)分子式為 C19H18O8,相對分子質量374.35,恪點為186~187°C，純品為淡黃色晶體。紫花牡荊素學名5， 3 二羥基-3，6，7，4 四甲氧基黃酮，又叫蔓荊子黃素，屬于多甲氧基黃酮類化合物。
[0029]所述載藥脂質體的藥脂比為1:20~40，具體可為1:30;
[0030] 所述藥脂比指的是所述藥物的質量與所述靶向脂質體中的所述卵磷脂和所述膽 固醇的質量之和的比值。
[0031] 本發(fā)明提供的載藥脂質體可用于治療肺癌，所述肺癌可為肺腺癌，具體可為A549 肺腺癌。
[0032] 本發(fā)明所述載藥脂質體能夠誘導肺癌細胞的凋亡，所述肺癌細胞可為肺腺癌細 胞，具體可為A549肺腺癌。
[0033]本發(fā)明將TF修飾到脂質體表面，增強肺靶向的能力，同時具有靶向腫瘤細胞的作 用;將抗腫瘤藥紫花牡荊素包載到脂質體中，得到靶向功能的靶向肺癌細胞的脂質體，能使 藥物到達病灶部位，并預期能有效防止腫瘤復發(fā)。本發(fā)明為徹底根治肺癌帶來了希望，具有 重要的理論意義與臨床意義。
【附圖說明】
[0034]圖1為本發(fā)明載藥脂質體(TF-CAS-脂質體)的透射電鏡照片。
[0035]圖2為本發(fā)明載藥脂質體(TF-CAS-脂質體)的藥物釋放曲線。
[0036]圖3為A549肺腺癌細胞的形態(tài)。
[0037]圖4為不同載藥脂質體對A549肺腺癌細胞的抑制作用。
[0038]圖5為激光共聚焦法檢測細胞對不同載藥脂質體的攝取及其在細胞內的分布行 為，其中，圖5(A1)、圖5(A2)和圖5(A3)表示細胞對游離紫花牡荊素(CAS)的攝取及其在細胞 內的分布行為，圖5(B1)、圖5(B2)和圖5(B3)表示細胞對CAS-脂質體的攝取及其在細胞內的 分布行為，圖5(C1)、圖5(C2)和圖5(C3)表示細胞對TF-CAS-脂質體的攝取及其在細胞內的 分布行為。
[0039]圖6為A549肺腺癌細胞對不同載藥脂質體的攝取能力，其中，圖6(A)表示A549肺腺 癌細胞對空白脂質體的攝取能力，圖6(B)表示A549肺腺癌細胞對紫花牡荊素-脂質體的攝 取能力，圖6(C)表示A549肺腺癌細胞對TF-紫花牡荊素-脂質體的攝取能力。
[0040]圖7為不同載藥脂質體對A549肺腺癌細胞的凋亡作用，其中，圖7(A)表示游離紫花 牡荊素(CAS)對A549肺腺癌細胞的凋亡作用，圖7(B)表示CAS-脂質體對A549肺腺癌細胞的 凋亡作用，圖7(C)表示TF-CAS-脂質體對A549肺腺癌細胞的凋亡作用。
【具體實施方式】
[0041 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 下述實施例所用的試劑和儀器如下：
[0044] 1、實驗試劑和細胞
[0045] 蛋黃卵磷脂（EPC)購自Germany Lipoid company ,ShangHai local agent ,China; 膽固醇(cholesterol)購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇（DSPE-TOG2000)購自日本油脂株式會社（日本NOF公司）；轉鐵蛋白（TF)、葡聚糖凝膠 (shephedex G