C水浴搖床中振蕩消化180min。加入30mL的DMEM/F12， 反復(fù)吹打，細(xì)胞篩過(guò)濾，收集濾液。濾液用1000轉(zhuǎn)/min離心10min，棄上清，將離心沉淀下來(lái) 的細(xì)胞按I X IO6AiL的密度用含10%FBS(胎牛血清)的DMEM/F12接種于培養(yǎng)瓶中，移入培養(yǎng) 箱中進(jìn)行培養(yǎng)。次日首次換液，以后每3d換液1次。
[0061 ] S3a、傳代培養(yǎng)
[0062]當(dāng)細(xì)胞達(dá)融合后，用胰蛋白酶（胰蛋白酶溶液配制：PBS緩沖液200mL，胰蛋白酶 0.5g，EDTA(乙二胺四乙酸)0.04g)不完全消化進(jìn)行傳代純化，至獲得第三代間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0063]血小板血漿裂解液的制備過(guò)程包括以下步驟：
[0064] Slb、無(wú)菌條件下用含lOOU/ml低分子量肝素鈉的無(wú)菌針管從髂后上脊取骨髓 30ml，生物安全柜中轉(zhuǎn)入50ml的無(wú)菌離心管中，在200g/min的條件下離心6min，離心后可見(jiàn) 骨髓分為3層，吸取上層及中間富含有核細(xì)胞層至另一離心管，1000 g離心6min，棄上清液； 下層加入DMEM培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為10%血清+8U/ml強(qiáng)力霉素+3U/ml肝素），于37°C，體積 分?jǐn)?shù)為5 % CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。
[0065] S2b、取原代培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液于200g條件下離心5分鐘，吸取上層血漿和下層2~ 3mm紅細(xì)胞層進(jìn)行第二次離心200g，離心5分鐘，取上層血漿和下層Imm紅細(xì)胞層進(jìn)行第三次 離心800g，離心10分鐘，至細(xì)胞液分三層，棄上層大部分血清，將剩余血清、白膜樣物質(zhì)層和 下層細(xì)胞混勻后置于_80°C冰箱內(nèi)保存，第二天取出，為防止蛋白質(zhì)沉淀，在37°C恒溫水浴 中解凍時(shí)間不能超過(guò)5分鐘，反復(fù)凍存解凍至少3次以上便可得到血小板血漿裂解液。
[0066] 實(shí)施例2
[0067] 本實(shí)施例提供的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，包括以下成分，且各成分在細(xì) 胞制劑中的濃度如下：
[0068] 間充質(zhì)干細(xì)胞2X IO7個(gè)/ml;
[0069] 血小板血漿裂解液5 %;
[0070] 人血清蛋白20mg/ml;
[0071] 檸檬酸鈉調(diào)節(jié)注射劑PH=5.0;
[0072] 氯化鈉 0.1mol/L;
[0073] 法舒地爾 5ymol/L;
[0074] 強(qiáng)力霉素 lU/mL。
[0075] 其中，間充質(zhì)干細(xì)胞和血小板血漿裂解液的來(lái)源過(guò)程與實(shí)施例1基本相同。
[0076] 實(shí)施例3
[0077] 本實(shí)施例提供的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，包括以下成分，且各成分在細(xì) 胞制劑中的濃度如下：
[0078] 間充質(zhì)干細(xì)胞8X IO7個(gè)/ml;
[0079] 血小板血漿裂解液20 %;
[0080] 人血清蛋白80mg/ml;
[00811檸檬酸鈉調(diào)節(jié)注射劑PH=6.0;
[0082] 氯化鈉 0.5mol/L;
[0083] 法舒地爾 lOymol/L;
[0084] 強(qiáng)力霉素 lOT/mL。
[0085] 其中，間充質(zhì)干細(xì)胞和血小板血漿裂解液的來(lái)源過(guò)程與實(shí)施例1基本相同。
[0086]為進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明提供的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑的顯著效果，通過(guò)以 下實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行具體說(shuō)明。
[0087]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型構(gòu)建
[0088] SD免疫缺陷鼠，雌雄各半，體重約200~250g，隨機(jī)分為對(duì)照組(注射未加入其他的 單純干細(xì)胞制劑)和治療組1_3(分別注射對(duì)應(yīng)本發(fā)明中實(shí)施例1-3)。通過(guò)化學(xué)方法灼傷建 立皮膚損傷模型，分別隔離相同環(huán)境下飼養(yǎng)。以上各組治療開(kāi)始后，分別于3d、7d、14d觀察 傷口愈合情況，計(jì)算傷口愈合指數(shù)(WCI): WCI ( % ) = (1-現(xiàn)創(chuàng)面面積/原創(chuàng)面面積）X 100 %， 結(jié)果如下表1:
[0089]表1
[0091] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由表1數(shù)據(jù)可知，治療組1~3皮膚傷口愈合面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組，且治 療組1~3的皮膚傷口愈合速度較快；由此可知，通過(guò)本發(fā)明提供的干細(xì)胞制劑能夠提高皮 膚傷口愈合的效率，能夠快速實(shí)現(xiàn)修復(fù)皮膚潰瘍的目的。
[0092] 綜上所述，本發(fā)明提供的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，通過(guò)采用間充質(zhì)干細(xì) 胞結(jié)合外源性細(xì)胞因子共同制成干細(xì)胞制劑，使得間充質(zhì)干細(xì)胞能夠定向向內(nèi)皮細(xì)胞分 化，而外源性細(xì)胞因子能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管的生成 以及膠原合成和肉芽的生長(zhǎng)，并能夠增加皮膚角化細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從而能夠?qū)崿F(xiàn) 快速修復(fù)因潰瘍損傷的皮膚的目的。
[0093] 以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方 式，上述的【具體實(shí)施方式】?jī)H僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā) 明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，這 些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，包括間充質(zhì)干細(xì)胞和外源性細(xì) 胞因子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，所述干細(xì)胞制 劑中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為(2~8) X107個(gè)/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，所述外源性細(xì) 胞因子包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子、類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子和P物質(zhì)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，所述外源性細(xì) 胞因子來(lái)源于血小板血漿裂解液。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，所述血小板血 漿裂解液的制備過(guò)程包括以下步驟： 無(wú)菌條件下，取骨髓，加入肝素鈉抗凝，離心至骨髓分層，取下層細(xì)胞層，加入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng) 基進(jìn)行原代培養(yǎng);取原代培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液離心后吸取上層血漿和下層紅細(xì)胞進(jìn)行第二次 離心，再次取上層血漿和下層紅細(xì)胞進(jìn)行第三次離心，棄上清液后，混勻，置于-50~-80°C 保存，24~36小時(shí)后取出，水浴解凍，反復(fù)凍存解凍至少三次，即可獲得血小板血漿裂解液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng) 基為含有體積分?jǐn)?shù)為5~15%血清、濃度為2~15U/ml的強(qiáng)力霉素以及1~5U/ml肝素的DMEM 培養(yǎng)基。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，所述干細(xì)胞制 劑中，所述血小板血漿裂解液的體積分?jǐn)?shù)為5~20%。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，所述間充質(zhì)干 細(xì)胞的獲取過(guò)程包括以下步驟： 獲取臍帶，于無(wú)菌條件下去除動(dòng)靜脈及外膜，PBS清洗，剪成段，再次清洗去除血液，然 后處理成肉糜狀，水浴消化后，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)吹打，過(guò)濾，收集濾液離心，棄上清，將 沉淀的細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，次日首次換液，之后每2~3天換液一次;待細(xì)胞 融合，不完全消化后，進(jìn)行傳代純化，獲得第三代間充質(zhì)干細(xì)胞完全消化后，繼續(xù)進(jìn)行傳代 培養(yǎng)。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，所述干細(xì)胞制 劑還包括20~80mg/ml的血清蛋白、梓檬酸鈉、0.1~0.5mol/L的氯化鈉和5~15ymol/L法舒 地爾。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，其特征在于，還包括1~ 15U/mL的強(qiáng)力霉素。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)皮膚潰瘍的干細(xì)胞制劑，包括間充質(zhì)干細(xì)胞和外源性細(xì)胞因子。通過(guò)采用間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合外源性細(xì)胞因子共同制成干細(xì)胞制劑，使得間充質(zhì)干細(xì)胞能夠定向向內(nèi)皮細(xì)胞分化，并通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌及外源性細(xì)胞因子能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管的生成以及膠原合成和肉芽的生長(zhǎng)，并能夠增加皮膚角化細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從而能夠?qū)崿F(xiàn)快速有效修復(fù)因潰瘍損傷的皮膚的目的。
【IPC分類(lèi)】A61K31/194, A61K31/551, A61K38/38, A61K35/28, A61K33/14, A61K35/17, A61K31/65, A61P17/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105708860
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610051116
【發(fā)明人】曾憲卓, 魯菲
【申請(qǐng)人】深圳愛(ài)生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月29日
【申請(qǐng)日】2016年1月26日