r>[0042] 1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0043] 6~10周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SPF環(huán)境飼 養(yǎng)。Hfe小鼠來(lái)自于Andrew Nancy教授的饋贈(zèng)，在浙江大學(xué)動(dòng)物中心SPF環(huán)境繁育?；A(chǔ)飼料 AIN-76A(鐵含量0.9mg/Kg，Research Diets, Inc)適應(yīng)喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分成對(duì)照組 和實(shí)驗(yàn)組，每組8只。對(duì)照組分別飼喂一月或兩月的標(biāo)準(zhǔn)飼料(購(gòu)自Research Diets，Inc)， 實(shí)驗(yàn)組分別飼喂一月或兩月的添加0.1% (w/w)腺嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)飼料后，用5%水合氯醛腹腔 麻醉，心臟采血(及時(shí)分離血清），并收集肝脾腎組織(液氮保存）。
[0044] 1.5RNA 提取和 Realtime-PCR
[0045] Trizol (Life Technologies)法提取Huh7(步驟 1.2和步驟1.3)和組織（步驟 1.4) 的RNA，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Nanodrop lOOOSpectropho tome ter上檢測(cè)RNA純度(0D260/ 0D280。1.9-2.1)及RNA濃度(ng/μL)，調(diào)整RNA濃度到lug/μΙ J.Oug RNA經(jīng)DNase(Promega) 處理后，]^-]\&^反轉(zhuǎn)錄酶(？1'〇111683)和0118〇((11')18口1'；!_11161'(131^以8;!_〇111(3.)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 CFX96Real-Time System( Bio-Rad)中進(jìn)行 Real time PCR，檢測(cè)體積為 10ul，試劑米用 iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)，引物序列如下：
[0046] HAMP:
[0064] 1.6ffestern blot
[0065] 用含有 PMSF(Sigma-Aldrich)和磷酸酶激活劑（PhosST0P，Roche)的 RIPA 裂解液 (碧云天生物技術(shù)研究所)裂解Huh7(步驟1.2和步驟1.3)和組織(步驟1.4)后，提取總蛋白。 細(xì)胞蛋白取30ug，肝組織蛋白取100ug，經(jīng)10%SDS-PAGE膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，該膜與特 異性抗體(如下所述一抗)4°C孵育過(guò)夜。洗滌三遍，與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(anti-rabbit or anti-mouse IgG 1:4000，Proteintech Group)室溫孵育1 小時(shí)后，Westernblot試劑盒 (ECL system，Pierce，Thermo Scientific)顯色。
[0066] 所用一抗如下：
[0067] 兔抗anti_pSmadl/5/8(l: 1000濃度稀釋?zhuān)籆ell Signaling Technology)，兔抗 anti_Smadl(l: 1000濃度稀釋?zhuān)籆ell Signaling Technology)，兔抗anti_pStat3(l: 1000濃 度稀釋?zhuān)籆e 11 Signal ing Technology)，兔抗an ti_Stat3(l : 1000濃度稀釋?zhuān)籆ell Signaling Technology)，兔抗 ant i-pErk 1/2(1 :1000濃度稀釋?zhuān)籆ell Signaling Technology)，兔抗 ant i_Erkl/2( 1:1000 濃度稀釋?zhuān)籆ell Signaling Techno logy )and鼠抗 antiP_actin( 1:2000濃度稀釋?zhuān)籗igma-Aldrich)。
[0068] 1.7統(tǒng)計(jì)方法
[0069]所用統(tǒng)計(jì)采用R軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean ± SD表示。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的組間比較 采用Tukey ' s檢驗(yàn)(AN0VA)，兩組間比較以Student ' s t-test檢驗(yàn)，以P〈0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。
[0070] 2 結(jié)果
[0071 ] 2.1腺嘌呤激活人肝癌細(xì)胞Huh7細(xì)胞HAMP基因表達(dá)
[0072]在體外培養(yǎng)Huh7細(xì)胞，腺嘌呤加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，處理12小時(shí)后，棄上清培養(yǎng)基， PBS漂洗3遍，Trizo 1法提取RNA，Real t ime-PCR檢測(cè)HAMP基因表達(dá)量(參見(jiàn)步驟1.2和1.5)。 每種活性單體每次處理設(shè)3復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0073] 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腺嘌呤可顯著激活Huh7細(xì)胞HAMP基因的表達(dá)且腺嘌呤激活HAMP基因的 表達(dá)程度與劑量和作用時(shí)間相關(guān)。腺嘌呤的濃度為50μΜ時(shí)，HAMP基因的表達(dá)量約為對(duì)照組 的4倍（圖1中Α) ΑΟμΜ的腺嘌呤處理，隨著時(shí)間的變化，HAMP表達(dá)量開(kāi)始上升，于處理12小時(shí) 后，達(dá)到最尚（圖1中B)。
[0074] 用含有 PMSF(Sigma-Aldrich)和磷酸酶激活劑(PhosSTOP，Roche)的 RIPA 裂解液 (碧云天生物技術(shù)研究所）裂解細(xì)胞或組織后，提取總蛋白。通過(guò)western-blot，檢測(cè) Hepcidin分子調(diào)控的主要信號(hào)通路BMP-SMAD、JAK-STAT、ERK中各因子的表達(dá)情況。Western Blot結(jié)果顯示，DMS0配制的0μΜ、10μΜ、20μΜ、50μΜ、100μΜ腺嘌呤溶液處理Huh7細(xì)胞12h，磷酸 化Smadl/5/8蛋白表達(dá)水平亦顯著上調(diào)（圖1中150μΜ腺嘌呤處理Huh7細(xì)胞12小時(shí)后， Smadl/5/8蛋白磷酸化的水平顯著被激活（圖1中D)，這提示腺嘌呤通過(guò)上調(diào)Smadl/5/8蛋白 的磷酸化水平激活Hepcidin mRNA表達(dá)。
[0075] 2.2腺嘌呤激活HAMP基因的轉(zhuǎn)錄
[0076] 利用Huh7細(xì)胞株，按照FuGENE?HD Transfection Reagent-Promega轉(zhuǎn)染系 統(tǒng)，共同轉(zhuǎn)染HAMP-promoter2.7kb-pGL3和內(nèi)參Reni 1 la報(bào)告基因質(zhì)粒。共轉(zhuǎn)24h后，處理不 同濃度的腺嘌呤，終濃度分別為1(^1、2(^11、5(^、10(^。處理2411后，裂解收集細(xì)胞，離心取 上清，用Dual-Luciferase Reporter Assay System測(cè)定裂解細(xì)胞上清內(nèi)Luciferase(HAMP Luc和Renilla Luc)活性，計(jì)算HAMP Luc/Renilla Luc比值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腺噪呤隨著濃度的 增加能顯著激活HAMP Luc的相對(duì)活性，50μΜ的濃度時(shí)，HAMP Luc的相對(duì)活性比對(duì)照組上調(diào)1 倍(圖2)。
[0077] 2.3腺嘌呤激活Hfe小鼠肝臟HAMP基因表達(dá)
[0078] 4周齡Hfe+小鼠隨機(jī)分為兩組，雄鼠和雌鼠分別設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(η = 6)。飼喂 1%〇腺嘌呤飼料，分別處理30天和60天，5 %水合氯醛水溶液腹腔麻醉后，心臟取血。Trizol 法提取肝臟RNA，Real-time PCR檢測(cè)Hampl表達(dá)（圖3中A)。同時(shí)提取肝臟蛋白，以Western Blot方法檢測(cè)BMP/Smad通路和MEK/ERK相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)（圖3中B)，發(fā)現(xiàn)該兩條通路被 顯著激活。腺嘌呤通過(guò)激活BMP/Smad和MEK/ERK通路激活h印cidin的表達(dá)。Western-blot結(jié) 果顯示實(shí)驗(yàn)組p-Smadl/5/8蛋白表達(dá)增加，p-ERK蛋白表達(dá)增加，表明adenine可能通過(guò)該兩 條通路調(diào)控hep c i d i η的表達(dá)。
[0079] 2 · 4腺嘌呤通過(guò)BMP/Smad和MEK/ERK通路上調(diào)Hampl的表達(dá)。
[0080] 加入這兩種通路的抑制劑LDN19389(圖4中A)和U0-126(圖4中B)，以及同時(shí)加入上 述兩種抑制劑（圖4中C)，Real-time檢測(cè)Hampl的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)兩種通路相關(guān)信 號(hào)分子的表達(dá)。分別加入單個(gè)抑制劑，腺嘌呤上調(diào)Hampl的能力明顯減弱，同時(shí)加入兩種抑 制劑，Hampl幾乎不表達(dá)，及時(shí)同時(shí)加入腺嘌呤，也無(wú)法上調(diào)Hampl。說(shuō)明BMP/Smad和MEK/ERK 通路在腺嘌呤激活Hampl的過(guò)程中均發(fā)揮作用。
[0081] 2.5腺嘌呤顯著降低Hfe小鼠血清鐵、肝臟非血紅素鐵含量及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。腺 嘌呤飼喂后，hepcidin分泌的增加，導(dǎo)致腸道鐵的吸收減少，雌雄組小鼠血清鐵均顯著降低 (圖5中A)，機(jī)體可利用的鐵減少，肝臟作為鐵儲(chǔ)存的器官，其非血紅素鐵含量也明顯減少 (圖5中C)。病理狀態(tài)下，Hfe小鼠由于鐵過(guò)載，其轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度很高，不同時(shí)間的腺嘌呤膳 食飼喂后，雌雄組小鼠的轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度均有降低，其鐵蓄積狀況得到改善（圖5中B)。表明 腺嘌呤膳食能夠緩解小鼠體內(nèi)鐵蓄積的癥狀，治療遺傳性血色素病。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 腺嘌呤在制備調(diào)控hepcidin表達(dá)藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為激活hepcidin表達(dá)的藥物。3. 如權(quán)利要求1-2之一所述的應(yīng)用，其特征在于所述調(diào)控hepcidin表達(dá)藥物為治療遺 傳性血色病、地中海貧血、鐵超載的酒精性肝炎、病毒性肝炎、脂肪肝或高鐵誘發(fā)的腫瘤藥 物。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物由腺嘌呤和食品或藥品上可接受的 載體制成，所述腺嘌呤質(zhì)量終濃度為〇. 05%-0.2%。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物劑型包括片劑、膠囊、或顆粒劑。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種腺嘌呤在制備調(diào)控hepcidin表達(dá)藥物中的應(yīng)用，所述藥物為激活hepcidin表達(dá)的藥物；目前治療遺傳性血色素沉著癥的鐵螯合劑毒性作用大，而放血療法一些病人不能耐受，肝移植風(fēng)險(xiǎn)高花費(fèi)大，直接給予hepcidin治療價(jià)格昂貴，難以持久；腺嘌呤作為主要治療白細(xì)胞減少癥臨床藥物毒副作用小，價(jià)格合適，易于長(zhǎng)期使用；本發(fā)明所述腺嘌呤能夠明顯促進(jìn)肝臟Hepcidin的分泌，降低血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度，顯著降低肝臟鐵水平，減緩小鼠血色病表型；開(kāi)拓了腺嘌呤的新用途，為因Hepcidin調(diào)控紊亂引起的鐵代謝疾病及相關(guān)并發(fā)癥治療提供了可能，特別在相關(guān)疾病的臨床藥物開(kāi)發(fā)有著潛在的應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】A61P3/00, A61P31/12, A61P1/16, A61P7/06, A61K31/52, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105726543
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610096986
【發(fā)明人】王福俤, 張英琪, 閔軍霞, 尹香菊, 謝恩軍
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年7月6日
【申請(qǐng)日】2016年2月22日