中藥當(dāng)歸提取物在制備抗耐藥菌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及中藥當(dāng)歸提取物在制備抗耐藥菌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，微生物的耐藥強(qiáng)度越來越高、耐藥譜越來越廣，耐藥性形 成的速度與抗菌素滅菌能力成比例上升。耐藥性一旦產(chǎn)生，將會保持下去。抗生素的繼續(xù)使 用，只會為高耐藥菌株繼續(xù)提供選擇壓力，促進(jìn)其復(fù)制、組構(gòu)及共同享用耐藥基因，導(dǎo)致多 重耐藥菌株的加快形成。目前，抗生素耐藥性已經(jīng)成為全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。
[0003] 我國每年因抗生素濫用導(dǎo)致800億元醫(yī)療費(fèi)用增長，同時(shí)致使8萬病人因其不良反 應(yīng)死亡。因?yàn)椋徽摷不驾p重、手術(shù)大小，都在使用抗生素、并且傾向于高效價(jià)抗生素和經(jīng)常 大量盲目長時(shí)間聯(lián)合用藥、個(gè)別甚至在短期內(nèi)用到4種以上的抗生素而導(dǎo)致新的耐藥菌株 不斷出現(xiàn)。有專家預(yù)言，我國可能率先進(jìn)入"后抗生素時(shí)代"，即回到抗生素發(fā)現(xiàn)之前的時(shí) 代。
[0004] 我國擁有極其豐富的中藥和天然藥物資源，藥用植物近萬種，為新藥發(fā)現(xiàn)提供了 豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)和來源。而且，用中成藥替代抗生素進(jìn)行抗菌、消炎，具有不良反應(yīng)及副作 用相對較小、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。另一方面，世界醫(yī)學(xué)界已有40年的時(shí)間里沒有真正意義 上的新型抗生素誕生。因此，許多科研工作者不由自主地把目光集中在天然藥材"抗生素" 上。從傳統(tǒng)中藥資源中找到同樣有抗菌消炎療效的抗生素替代性產(chǎn)品，將能很好地解決抗 生素耐藥性這一世界難題。
[0005] 近年來，細(xì)菌群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)系統(tǒng)已成為研究新型抗耐藥菌藥物 的重要靶標(biāo)。QS是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間信號傳遞的一種方式，通過監(jiān)控某些信號分子(又稱 自體誘導(dǎo)分子)如高絲氨酸內(nèi)酯(3〇71-1101]10861'；[116 1301：0116,41)的濃度，來控制并協(xié)調(diào)整 個(gè)細(xì)菌群體行為，共同對周圍環(huán)境刺激做出反應(yīng)，極大增強(qiáng)了整個(gè)細(xì)菌群體的生存能力。
[0006] 綠假單胞菌(P.aeruginosa)具有很強(qiáng)的在組織表面形成生物膜的能力，并且其QS 系統(tǒng)研究得也最為透徹，因此銅綠假單胞菌被選做本項(xiàng)目研究的模式菌。銅綠假單胞菌是 一種重要的條件致病菌，常常引起呼吸道感染、肺炎、泌尿道感染等醫(yī)院內(nèi)感染，被認(rèn)為是 病人在醫(yī)院期間發(fā)生感染的第三大致病菌，嚴(yán)重危害著人類的健康與生命。銅綠假單胞菌 高的內(nèi)在抗藥性與其群體感應(yīng)系統(tǒng)密不可分，該QS系統(tǒng)控制著包括生物膜、外毒素、彈性蛋 白酶、溶血素、綠膿菌素等幾乎所有致病因子的表達(dá)。這些致病因子決定了銅綠假單胞菌對 宿主的致病能力。其中，生物膜的形成和擴(kuò)散是造成P.aeruginosa多重耐藥的一個(gè)重要機(jī) 制。美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)發(fā)布的一份權(quán)威調(diào)查報(bào)告指出，人類微生物感染有超過80% 是通過細(xì)菌生物被膜(Biofilm，BF)介導(dǎo)的。BF作為一種細(xì)菌群體行為，其分化與發(fā)育與細(xì) 菌群體感應(yīng)密切相關(guān)。細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)完整的細(xì)菌可以形成發(fā)育和分化正常的、典型的 能對抗殺菌劑的生物膜，而細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)殘缺的的細(xì)菌則不能形成典型的生物膜，對 抗生素的抵抗力顯著下降，并且容易被沖洗掉以及對殺菌劑敏感。因此，通過猝滅控制細(xì)菌 生物膜形成和病原菌毒力因子表達(dá)的QS系統(tǒng)，因不直接抑制細(xì)菌生長、不會對細(xì)菌產(chǎn)生選 擇性壓力，將很有希望獲得作用于新靶點(diǎn)、不會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的群感抑制劑（QS inhibitors，QSI)〇
[0007] 當(dāng)歸為傘形科藁本植物當(dāng)歸Angelica sinenSis(01 iv)DieIs的干燥根莖，味甘， 性辛、溫，歸肝、心、脾經(jīng)，具補(bǔ)血和血、調(diào)經(jīng)止痛之功效。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其 藥效獨(dú)特，歷來是醫(yī)家珍品，素有"十方九歸"之稱。系統(tǒng)查閱當(dāng)歸的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代藥理和 臨床研究也表明當(dāng)歸具有良好的抗菌抗炎作用，但是沒有發(fā)現(xiàn)其抗耐藥菌及其抑制細(xì)菌群 體感應(yīng)系統(tǒng)的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的首要目的在于提供當(dāng)歸提取物制備抗耐藥菌藥物的用途，具體的為當(dāng)歸 提取物制備抗耐藥銅綠假單胞菌藥物的用途，所述當(dāng)歸提取物通過抑制細(xì)菌生物膜發(fā)揮其 抗菌和/或抗耐藥菌的效果，具體的所述當(dāng)歸提取物進(jìn)一步的使用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇 進(jìn)行萃取，獲得當(dāng)歸提取物浸膏的氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層流份或其提取物大 孔吸附樹脂的乙醇水溶液洗脫部分。
[0009] 優(yōu)選的所述提取浸膏采用回流提取或冷浸提取。
[0010] 優(yōu)選的大孔吸附樹脂乙醇水溶液洗脫液依次為20%、50%、70%和95%的乙醇水 溶液。
[0011]更優(yōu)選的當(dāng)歸回流提取的溶劑為50 %-95%的乙醇溶液，當(dāng)歸冷浸提取的溶劑為 甲醇。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供一種當(dāng)歸提取物的抗耐藥菌藥物組合物，所述藥物組合 物包含上述當(dāng)歸提取物和藥學(xué)上可接受的輔料。
[0013] 優(yōu)選的所述藥物組合物為口服制劑。
[0014] 更優(yōu)選的所述口服制劑為膠囊劑、片劑和顆粒劑等。
[0015] 本發(fā)明的再一目的為提供一種抗耐藥菌的當(dāng)歸提取物的制備方法，所述當(dāng)歸提取 物采用當(dāng)歸回流提取或冷浸提取，提取液進(jìn)一步采用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取或使用大孔吸附樹 脂進(jìn)行乙醇溶液梯度洗脫制得。
[0016] 優(yōu)選的有機(jī)溶劑為氯仿、乙酸乙酯、正丁醇；
[0017] 優(yōu)選的進(jìn)行大孔吸附樹脂梯度洗脫的乙醇溶液依次為20 %、50 %、70 %和95 %乙 醇水溶液。
[0018] 更優(yōu)選的當(dāng)歸回流提取的溶劑為50 %-95%的乙醇溶液，當(dāng)歸冷浸提取的溶劑為 甲醇。
[0019] 具體的所述抗耐藥菌的當(dāng)歸提取物按照以下回流提取、有機(jī)溶劑萃取或大孔吸附 樹脂梯度洗脫方法制備，具體的包括以下步驟：
[0020] (1)當(dāng)歸干燥根粉碎，50 % -95 %乙醇回流提取2-3次，每次1-2小時(shí)，合并提取液；
[0021] (2)減壓濃縮提取液，得到乙醇浸膏；
[0022] (3)乙醇浸膏采用有機(jī)溶劑萃取或大孔吸附樹脂的梯度洗脫，即得有機(jī)溶劑萃取 流份和大孔吸附樹脂洗脫部分。
[0023] 優(yōu)選的，步驟（1)采用60%-95%乙醇回流提取2-3次，更優(yōu)選的為采用95%乙醇回 流提取2次，每次提取2小時(shí)，合并提取液。
[0024] 優(yōu)選的當(dāng)步驟(3)乙醇浸膏采用有機(jī)溶劑萃取時(shí)，其具體步驟為乙醇浸膏依次用 等體積的氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇分別萃取三次，分別減壓回收各萃取部分溶劑，得 到氯仿可溶部分(ASC)，乙酸乙酯可溶部分(ASE)，正丁醇可溶部分(ASB)，和水層(ASW)，即 得。
[0025] 優(yōu)選的當(dāng)步驟(3)采用大孔吸附樹脂梯度洗脫時(shí)，其具體步驟為進(jìn)行大孔樹脂開 放柱層析，依次用體積百分比為20 %的乙醇水溶液、50%的乙醇水溶液、70 %的乙醇水溶 液、95%的乙醇水溶液洗脫大孔樹脂開放柱，得到各部分洗脫液，減壓回收各洗脫部分溶 劑，得到20 %乙醇水溶液洗脫部分，50 %乙醇水溶液洗脫部分，70 %乙醇水溶液洗脫部分和 95%乙醇水溶液洗脫部分，即得。
[0026]本發(fā)明的有益效果：
[0027] 本發(fā)明提供了當(dāng)歸提取物的一種新的用途，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的當(dāng)歸提取物及 其有機(jī)溶劑萃取流份和大孔吸附樹脂梯度洗脫部分可以抑制銅綠假單胞菌和耐藥銅綠假 單胞菌的生物膜，顯示了本發(fā)明當(dāng)歸提取物及其有機(jī)溶劑萃取流份和大孔吸附樹脂梯度洗 脫部分對于銅綠假單胞菌的抑制效果，更突出的是本發(fā)明的當(dāng)歸提取物及其有機(jī)溶劑萃取 流份和大孔吸附樹脂梯度洗脫部分對于耐藥銅綠假單胞菌同樣顯示了明顯的抑制作用，從 而提供了一種非抗生素類的抗耐藥菌藥物，并有助于避免抗生素耐藥問題。
【附圖說明】
[0028] 圖1為當(dāng)歸提取物各萃取層對銅綠假單胞菌生物膜的吸光度值；
[0029] 圖2為當(dāng)歸提取物及各溶劑萃取部分對銅綠假單胞菌生物膜的抑制活性的電子掃 描顯微鏡圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面將進(jìn)一步的來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要 求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所 附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0031] 實(shí)施例1:當(dāng)歸提取物的制備方法
[0032] (1)當(dāng)歸干燥根10kg，粉碎，用10倍量當(dāng)歸重量的95%乙醇回流提取3次，每次2小 時(shí)，合并提取液；
[0033] (2)減壓濃縮提取液，得到乙醇浸膏1700g。
[0034] (3)乙醇浸膏依次用等體積的氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇分別萃取三次；
[0035] (4)分別減壓回收各萃取部分溶劑，得到氯仿可溶部分(ASC)420g，乙酸乙酯可溶 部分(ASE)87g，正丁醇可溶部分(ASB)725g，和水層(ASW)356g。
[0036]實(shí)施例2:當(dāng)歸提取物的制備方法
[0037] (1)當(dāng)歸干燥根5kg，粉碎，用20倍當(dāng)歸重量的甲醇冷浸，冷浸兩次，每次兩個(gè)星期， 合并冷浸液；
[0038] (2)減壓濃縮冷浸液，得到甲醇提取物800g;
[0039] (3)將甲醇提取物的水混懸液，進(jìn)行大孔樹脂開放柱層析，依次用體積百分比為 20 %的乙醇水溶液、50 %的乙醇水溶液、70 %的乙醇水溶液、95 %的乙醇水溶液洗脫大孔樹 脂開放柱，得到各部分洗脫液；
[0040] (4)分別減壓回收各洗脫部分溶劑，得到20%乙醇水溶液洗脫部分236g，50%乙醇 水溶液洗脫部分125g，70 %乙醇水溶液洗脫部分183g，和95 %乙醇水溶液洗脫部分117g。 [0041 ]實(shí)施例3:當(dāng)歸提取物的制備方法
[0042] (1)當(dāng)歸干燥根3kg，粉碎，用8倍當(dāng)歸重量的60%乙醇回流提取三次，每次2小時(shí)， 合并提取液；
[0043] (2)減壓濃縮提取液至無醇味，得到乙醇提取物的水混懸液。
[0044] (3)乙醇提取物的水混懸液進(jìn)行大孔樹脂開放柱層析，依次用體積百分比為10% 的乙醇水溶液、30 %的乙醇水溶液、50 %的乙醇水溶液、70 %的乙醇水溶液、95 %的乙醇水 溶液洗脫大孔樹脂開放柱，得到各部分洗脫液；
[0045] (4)分別減壓回收各洗脫部分溶劑，得到10%乙醇水溶液洗脫部分8