和DNA測序來證實插入。所得質(zhì)粒稱為pET24d-Ex-4ELPl-90(圖2A)，所得毒蜥外泌 肽-4-ELP融合物的序列見圖2B。還標明了用于融合物構建的引物。
[0413] 使用pET24d-Ex-4ELPl-90轉化大腸桿菌菌株BRL(Invitrogen)，將選出的轉化株 在搖瓶內(nèi)的培養(yǎng)基3(1.2%胰胨/蛋白胨(Tryptone ?6口1:〇116)、2.4%酵母提取物、58/1酪蛋 白氨基酸、2%甘油、2.313g磷酸氫二鉀/L、12.541g磷酸二氫鉀/L)中生長。將10D細胞接種 至1L培養(yǎng)基3中，使之在未加入誘導物時于37°C繼續(xù)生長17小時，通過自體誘導繼續(xù)生產(chǎn)。 收集細胞沉淀回收產(chǎn)物，超聲處理破壞細胞，通過由ELP部分調(diào)節(jié)的熱和/或鹽誘導的轉變 來回收（Improved Non-chromatographic Purification of a Recombinant Protein by Cationic Elastin-like Polyrpeptides(通過陽離子彈性蛋白樣多肽改進非層析純化的 重組蛋白質(zhì)），Dong Woo Lim，Kimberly Trabbic_Carlson，J.Andrew MacKay和Ashutosh Chilkoti·Biomacromolecules 2007，8，1417-1424)〇
[0414] 該實施例用命名為1-90的ELP。其基礎是VPGXG(SEQ ID N0:3)基序，其中在10個單 元重復中，X為比率為5:3: 2的V、G或A，重復8次加上其中X為V、G、A和W，比率4: 3:2:1的最終 (C端)的10單元重復。
[0415] [(VPGXG)10]9,其中重復單元10次連接重復的X殘基（下標數(shù)字）可表示為
[(Vl, 4,5,6, l0G2, 7, 9^3,8) 8(Vl, 4,5,602,7, 9^3, 8^10)]。
[0416] ELP可以是其中X為脯氨酸以外的任何20個天然氨基酸的VPGXG(SEQIDN0:3)單 元的任何組合，可以是任何長度的重復單元的任何組合。此外，對于被工程改造以接受在特 定密碼子中摻入經(jīng)工程改造的tRNA的宿主菌株，氨基酸可以是非天然氨基酸（Wang L， Brock A,Herberich B,Schultz PG.Expanding the genetic code of Escherichia coli (大腸桿菌遺傳密碼的擴展）.[2001]Science 292，498_500) 〇
[0417] 該構建體在具有N端甲硫氨酸的細胞溶膠中產(chǎn)生，所述N端甲硫氨酸通常被甲硫氨 酸氨基肽酶除去。然而，無法確保完全準確地加工甲硫氨酸;該酶還可除去毒蜥外泌肽-4部 分的N端組氨酸。這可能產(chǎn)生未加工的、加工的和非正確加工的產(chǎn)物的混合物。因此，研發(fā)出 另外的構建體以產(chǎn)生具有正確加工的N端產(chǎn)物。
[0418] 設計出在N端甲硫氨酸與毒蜥外泌肽-4的N端組氨酸之間加入Tev蛋白酶(煙草蝕 斑病毒半胱氨酸蛋白酶)切割位點的引物。這可供除去甲硫氨酸和Tev識別序列，以便得到 毒蜥外泌肽-4的成熟N端(組氨酸）。這可在后制備期進行，或者Tev蛋白酶可以在制備期間 共表達以切割例如作為內(nèi)含肽的識別序列（Ge，X.，Yang，D.S.C.，Trabbic-Carlson，K.， Kim,B.,Chilkoti，A?和Filipe，C.D.M.Self_Cleavable Stimulus Responsive Tags for Protein Purification without Chromatography(非層析法的蛋白質(zhì)純化自體切害[j朿lj激 物反應標簽）.11.六!11.016111.50(；.127，11228-11229,2005) <^6￥毒蜥外泌肽-4序列見圖3厶。圖 3B圖示額外加入的標為"接頭Tev"的序列，提供更好的Tev蛋白酶靶標。
[0419] 獲得Ex-4正確加工的N端的一個替代途徑是使用將產(chǎn)物引導至周質(zhì)的前導序列或 信號序列，其在加工中被信號肽酶切割。在這種情況下，提供將轉錄物引導至信號識別顆粒 的信號序列DsbA，用于多肽直接分泌至周質(zhì)（參見圖4A)。質(zhì)粒pET24d-DsbA-Ex-4ELPl-90見 圖4B。
[0420] 雖然該實施例說明了具有毒蜥外泌肽-4序列的治療劑的制備，但是這類序列可用 GLP-1、胰島素、因子VII/VIIa或表1所列的其它治療性蛋白質(zhì)替換，按與毒蜥外泌肽-4所述 方式完全一樣或類似的方式制備。
[0421] 實施例6:GLP1_ELP融合蛋白
[0422] ELP質(zhì)粒構建體用于制備兩種GLP1-ELP融合蛋白，GLP1(A8G，7-37)ELP1-9(^PGLP1 (A8G，7-37) ELP1-120。質(zhì)粒構建體、編碼融合物的核苷酸序列以及所得融合蛋白的氨基酸 序列見圖5和圖6。
[0423]兩個構建體均含有N端Tev蛋白酶位點以供加工其中GLP1的His7位于N端的成熟形 式。加工的融合蛋白的分子量計算值分別為約39，536和約50，828。
[0424] 實施例7:FVII ELP融合蛋白
[0425] 凝血因子VII(FVII)基因從cDNA克?。∣ragene)通過PCR修飾，在5'和3'端加入用 于克隆至含有ELP的載體的限制位點。在5'端加入Nhel位點，在3'端加入Notl位點。因子VII 基因的DNA和氨基酸序列見隨附的序列表，分別為SEQ ID N0:34和33。用于PCR擴增因子VII (FVII)基因的5'和3'引物的DNA序列為：
[0426] P13：CTAGCTAGCATGGTCTCCCAGGCCCTC(SEQ ID NO：49)
[0427] P14：TATTCTTGCGGCCGCGGGAAATGGGGCTCGCAG(SEQ ID N0：50)
[0428] 所得PCR片段用限制酶Nhel和Notl消化，將其連接入之前已用限制酶Nhel和Notl 消化的質(zhì)粒PCDNA3 · 1+ELP1 -90 (圖 7A)。
[0429] 將所得質(zhì)粒pcDNA3.1+FVII-ELPl-90瞬時轉染至HEK293細胞，收獲培養(yǎng)基。ELP融 合物通過相變純化(圖9和圖10)。
[0430]因子VII-ELP融合物的核苷酸和氨基酸序列見圖7B。正如所顯示的一樣，因子VII-ELP融合蛋白在因子VII成分和ELP成分之間含有Tev蛋白酶接頭。這個接頭是任選的。
[0431] 實施例8:胰島素 ELP融合蛋白
[0432] 在5'和3'端對人胰島素基因的cDNA進行修飾以插入pET24d-ELPl-90。5'引物加入 用于細菌表達的N端甲硫氨酸和NdeI限制酶位點。3 '引物加入XhoI限制酶位點。PCR產(chǎn)物和 質(zhì)粒兩者都用限制酶Nde I和Xho I消化并連接在一起。與ELP 1融合的胰島素 B鏈、C鏈和A鏈的 序列見圖8A。
[0433] 正確的插入通過限制酶切消化和DNA測序來確定。所得質(zhì)粒命名為pET24d胰島素 -ELP1-90,見圖 8B。
[0434] 通過用胰蛋白酶和羧肽酶B處理除去C肽鏈，從大腸桿菌中回收后，得到天然胰島 素形式。
[0435] 對于B鏈N端的正確加工，可進行類似于制備毒蜥外泌肽-4融合物的修飾(蛋白酶 切割位點、信號序列）（參見實施例4)?；蛘?，前兩個殘基可以是Met-Arg，其也可在產(chǎn)生最終 產(chǎn)物時通過胰蛋白酶消化除去（R ·Μ· Belaga je，S · G · Reams，S · C · Ly and W. F · Prouty， Increased production of loff molecular weight recombinant proteins in Escherichia coli (提高大腸桿菌中低分子量重組蛋白的產(chǎn)生）· Protein Sci . 6,1953-1962，1997)。
[0436] 其它構建體可將胰島素 cDNA置于屬于C端融合物的ELP的3'端、在胰島素和ELP序 列之間加入接頭、和/或使用無 C肽的胰島素修飾形式(所述單鏈胰島素），避免了額外加工 的需要。
[0437] 實施例9:用于綴合的ELP基因的合成
[0438] 采用標準分子生物學方案，用化學合成的寡核苷酸構建了編碼50個氨基酸序列的 基因。50個氨基酸序列含有五肽VPGXG(SEQ ID N0:3)的10次重復，其中選擇客體殘基(V、G 和A，摩爾比率5:3:2)以提供40°C的Tt。通過標準分子生物學技術使基因首尾相接寡聚化， 產(chǎn)生寡聚ELP基因?；蛘邩嫿ê?0次重復的五肽VPGXG(SEQ ID N0:3)多肽的1個50個氨基 酸的序列，其中客體殘基為V、G、A和C，摩爾比率4: 3: 2:1。該序列可在寡聚過程的任何循環(huán) 中加入，以將單一半胱氨酸殘基在沿構建體區(qū)段的選定位點上引入最終構建體中。
[0439] 在此給出的實施例使用命名為1-90的ELP。這以其中X為V、G或A，比率5: 3: 2,10個 單元重復的VPGXG(SEQ ID N0:3)基序為基礎，重復8次加上其中X為V、G、A和C，比率4:3:2:1 的最終(C端）的 10單元重復，即[(VPGXG)10]9(SEQ ID N0:3)。
[0440] 或者，殘基可以是精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸或谷氨酸之一。這些氨基酸的目的是 提供用于例如胰島素的化學綴合的反應性側鏈。在這種具體情況下，使用ELP可延長治療性 蛋白質(zhì)(例如胰島素)的循環(huán)半壽期，以提供延長的基礎葡萄糖控制。與于體溫轉變的ELP綴 合的胰島素可按類似于LantuS?(Sanofi Aventis)的方式在注射部位形成沉積貯庫，但卻 不需要在酸性(pH 4.0)條件下使用間甲酚以使注射的耐受性更好。
[0441 ] 實施例10:因子VII-ELP的功效和半壽期
[0442] 圖11圖示因子VIIa-ELPl-90活化的因子X，因子Vila活化用作對照。因子VII-ELP 在HEK細胞中產(chǎn)生。因子Vila從人血漿中獲得。正如所顯示的一樣，因子VIIa-ELP保持了完 整活性。
[0443] 當通過靜脈內(nèi)給予大鼠時，因子VII-ELP顯示約690分鐘的半壽期。相比之下，因子 VII顯示45-60分鐘的半壽期。通過因子VII的夾心ELISA測定該實施例中的半壽期（圖12)。 [0444] 同樣相比之下，已報導的NovoSeven?的半壽期為45分鐘，已報導的因子Vila-白蛋 白融合物的半壽期為263分鐘，已報導的因子VIIa-PEG的半壽期在小鼠中為300分鐘，在狗 中為600分鐘。
[0445] 實施例11: GLP-1 (或毒蜥外泌肽-4)體外生物測定法
[0446] GLP-1受體(GLP1R)的活化導致細胞內(nèi)cAMP第二信使的產(chǎn)生。因此，可通過GLP-1或 毒蜥外泌肽-4類似物和相應的治療劑激活細胞表面上的GLP1R和產(chǎn)生cAMP的能力來進行測 試。
[0447] 對于該生物測定法，使用用編碼GLP1R的cDNA轉染的CH0細胞。這些細胞響應GLP-1 的刺激，并產(chǎn)生高水平的cAMP。接種對數(shù)期生長的細胞，將遞增濃度的受試化合物(例如本 發(fā)明的治療劑或GLP-1或毒蜥外泌肽-4功能類似物)加入細胞中。在生理緩沖液中于37°C的 適當溫育期后（通常15-60分鐘），采用得自Molecular Devices( Sunny vale，CA)的 CatchPoint cAMP測定盒，測定所產(chǎn)生的cAMP。與GLP-1肽或毒蜥外泌肽-4肽相比（或與本發(fā) 明治療劑的未融合或未綴合對應物相比），各受試化合物的EC 5Q表示由引入肽的特殊修飾引 起的活性變化，或由與ELP成分的特定化學的或重組偶聯(lián)所引起的活性變化。
[0448] 如圖13所示，與只有毒蜥外泌肽相比，GLP1-ELP(PB0868)和毒蜥外泌肽-4-ELP(PB 0859)兩者都保持體外高度活性。要注意的是，Albugon?和Liraglutide?的比活比毒蜥外 泌肽的低50-100倍。
[0449] 實施例12 :GLP_1 (或毒蜥外泌肽-4)體內(nèi)生物測定法
[0450]可在動物中測定GLP-1或毒蜥外泌肽類似物或相應治療劑的活性。對于本測定法， 可以使用正常動物或糖尿病動物。給血液葡萄糖濃度為300_500mg/dl的糖尿病動物注射不 同劑量的GLP-1或毒蜥外泌肽類似物或相應的治療劑，用血糖計監(jiān)測血液葡萄糖的變化。將 給藥后不同時間點葡萄糖的降低與用標準量的GLP-1或毒蜥外泌肽-4肽所得結果相比較， 或與本發(fā)明治療劑的未融合或未綴合對應物相比較?；蛘?，將在給予外源葡萄糖后特定時 期內(nèi)正常動物或糖尿病動物的血液葡萄糖波動與GLP-1或毒蜥外泌肽_4(或與治療劑的未 融合或未綴合對應物）的波動情況相比較。這樣，可將類似物和融合蛋白的活性與天然肽的 活性進行比較。
[0451 ]圖14圖示靜脈內(nèi)和皮下給予大鼠 GLP1-ELP1-120的藥代動力學特征。每個時間點 使用3只大鼠。劑量約為10mg/kg。當靜脈內(nèi)給藥時，T1/2約為^^^。當皮下給藥時，!^/：^ 為8.6小時。
[0452] 圖15圖示靜脈內(nèi)和皮下給予兔GLP1-ELP1-120的藥代動力學特征。每個時間點使 用3只兔。劑量約為lmg/kg。當靜脈內(nèi)給藥時，Τ 1/2約為20小時。當皮下給藥時，Τ1/2約為24小 時。
[0453] 圖16圖示用GLP1-ELP1 -90的糖尿病小鼠中的持續(xù)血糖控制。
[0454] 本文引用的全部參考文獻都通過引用其整體結合到本文中。雖然本文就本發(fā)明的 具體方面、特征和示例性實施方案對本發(fā)明進行了描述，但應當了解的是，本發(fā)明的應用并 不因此受到限制，相反延伸并包括各種其它的變化、修改和替代性實施方案，正如本發(fā)明領 域普通技術人員根據(jù)本文的公開內(nèi)容所理解的一樣。
【主權項】
1. 一種治療組合物，其包含GLP-1受體激動劑、由胰島素 A鏈和胰島素 B鏈構成的治療劑 以及藥學上可接受的載體或賦形劑，其中所述胰島素 A鏈是具有彈性蛋白樣肽的重組融合 物，所述彈性蛋白樣肽包含至少一個SEQ ID NO: 1-12中任一的重復單元。2. 權利要求1的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑選自： a) SEQ ID NO: 59； b) SEQ ID NO: 14； c) SEQ ID NO: 60； d) SEQ ID NO: 61； e) SEQ ID NO: 62； f) SEQ ID NO: 63； g) SEQ ID NO: 64； h) SEQ ID NO: 65； i) SEQ ID NO: 66； j) SEQ ID NO: 67;以及 k) SEQ ID NO: 68〇3. 權利要求2的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑是SEQ ID NO: 14。4. 權利要求2的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑是SEQ ID NO: 60。5. 權利要求2的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑是SEQ ID NO: 61。6. 權利要求2的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑是SEQ ID NO: 59。7. 權利要求1的治療組合物，其中所述胰島素 A鏈序列包含相對于SEQ ID NO: 15具有 約5個氨基酸插入、缺失和/或取代的氨基酸序列。8. 權利要求1的治療組合物，其中所述胰島素 B鏈序列包含相對于SEQ ID NO: 16具有 約5個氨基酸插入、缺失和/或取代的氨基酸序列。9. 權利要求1的治療組合物，其中所述胰島素 A鏈序列包含相對于SEQ ID NO: 15具有 約5個氨基酸插入、缺失和/或取代的氨基酸序列，并且所述胰島素 B鏈序列包含相對于SEQ ID NO: 16具有約5個氨基酸插入、缺失和/或取代的氨基酸序列。10. 權利要求1的治療組合物，其中所述胰島素 A鏈和所述胰島素 B鏈通過一個或多個二 硫鍵連接。11. 權利要求1的治療組合物，其中所述彈性蛋白樣肽包含至少90個VPGXG(SEQ ID NO: 3)的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸，相對比為5:2:3。12. 權利要求10的治療組合物，其中所述彈性蛋白樣肽包含至少120個VPGXG的重復單 元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸，相對比為5:2:3。13. 權利要求11的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑是SEQ ID NO: 14,所述胰島 素 A鏈序列包含相對于SEQ ID NO: 15具有約5個氨基酸插入、缺失和/或取代的氨基酸序 列，并且胰島素 B鏈序列包含相對于SEQ ID NO: 16具有約1至5個氨基酸插入、缺失和/或取 代的氨基酸序列。14. 權利要求1的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑是具有彈性蛋白樣肽的重組 融合物，所述彈性蛋白樣肽包含至少一個VPGXG的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨 酸，相對比為5:2:3。15. 權利要求14的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑是具有彈性蛋白樣肽的重組 融合物，所述彈性蛋白樣肽包含至少90個VPGXG的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨 酸，相對比為5:2:3。16. 權利要求15的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑是具有彈性蛋白樣肽的重組 融合物，所述彈性蛋白樣肽包含至少120個VPGXG的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘 氨酸，相對比為5:2:3。17. 權利要求14的治療組合物，其中所述GLP-1受體激動劑選自： a) SEQ ID NO: 59； b) SEQ ID NO: 14； c) SEQ ID NO: 60； d) SEQ ID NO: 61； e) SEQ ID NO: 62； f) SEQ ID NO: 63； g) SEQ ID NO: 64； h) SEQ ID NO: 65； i) SEQ ID NO: 66； j) SEQ ID NO: 67;以及 k) SEQ ID NO: 68〇18. -種治療或預防有需要的患者的糖尿病的方法，所述方法包括給予有效量的治療 組合物，所述治療組合物包含GLP-1受體激動劑、由胰島素 A鏈和胰島素 B鏈構成的治療劑以 及藥學上可接受的載體或賦形劑，其中所述胰島素 A鏈是具有彈性蛋白樣肽的重組融合物， 所述彈性蛋白樣肽包含至少一個SEQ ID NO: 1-12中任一的重復單元。19. 權利要求18的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。20. 權利要求18的方法，其中胃腸外給予所述治療組合物。21. 權利要求18的方法，其中所述胰島素 A鏈和所述胰島素 B鏈通過一個或多個二硫鍵 連接。22. 權利要求18的方法，其中所述GLP-1受體激動劑是具有彈性蛋白樣肽的重組融合 物，所述彈性蛋白樣肽包含至少一個VPGXG的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸， 相對比為5:2:3。23. 權利要求22的方法，其中所述GLP-1受體激動劑是具有彈性蛋白樣肽的重組融合 物，所述彈性蛋白樣肽包含至少90個VPGXG的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸， 相對比為5:2:3。24. 權利要求23的方法，其中所述GLP-1受體激動劑是具有彈性蛋白樣肽的重組融合 物，所述彈性蛋白樣肽包含至少120個VPGXG的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨 酸，相對比為5:2:3。25. 權利要求18的方法，其中所述GLP-1受體激動劑選自： a) SEQ ID NO: 59； b) SEQ ID NO: 14； c) SEQ ID NO: 60； d) SEQ ID NO: 61； e) SEQ ID NO: 62； f) SEQ ID NO: 63； g) SEQ ID NO: 64； h) SEQ ID NO: 65； i) SEQ ID NO: 66； j) SEQ ID NO: 67;以及 k) SEQ ID NO: 68〇26. -種治療或預防有需要的患者的糖尿病的方法，所述方法包括給予有效量的治療 組合物，所述治療組合物包含選自SEQ ID NO: 14、59、60和61的GLP-1受體激動劑、由胰島 素 A鏈序列和胰島素 B序列鏈構成的融合蛋白以及藥學上可接受的載體或賦形劑，所述胰島 素 A鏈序列包含相對于SEQ ID NO: 15具有約5個氨基酸插入、缺失和/或取代的氨基酸序 列，所述胰島素 B鏈序列包含相對于SEQ ID NO: 16具有約5個氨基酸插入、缺失和/或取代 的氨基酸序列，其中所述胰島素 A鏈是具有彈性蛋白樣肽的重組融合物，所述彈性蛋白樣肽 包含120個VPGXG (SEQ ID N0:3)的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸，相對比為 5:2: 3〇27. 權利要求26的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。28. 權利要求26的方法，其中胃腸外給予所述治療組合物。29. 權利要求26的方法，其中所述胰島素 A鏈和所述胰島素 B鏈通過一個或多個二硫鍵 連接。30. 權利要求26的方法，其中所述GLP-1受體激動劑是具有彈性蛋白樣肽的重組融合 物，所述彈性蛋白樣肽包含至少一個VPGXG的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸， 相對比為5:2:3。31. 權利要求30的方法，其中所述GLP-1受體激動劑是具有彈性蛋白樣肽的重組融合 物，所述彈性蛋白樣肽包含至少90個VPGXG的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸， 相對比為5:2:3。32. 權利要求31的方法，其中所述GLP-1受體激動劑是具有彈性蛋白樣肽重組融合物， 所述彈性蛋白樣肽包含至少120個VPGXG的重復單元，其中X為纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸，相 對比為5:2:3。
【專利摘要】本發(fā)明提供包含彈性蛋白樣肽(ELP)和治療性蛋白質(zhì)的治療劑和組合物。在一些實施方案中，治療性蛋白質(zhì)是GLP?1受體激動劑、胰島素或因子VII/VIIa，包括功能類似物。本發(fā)明還提供編碼多核苷酸，以及制備和使用所述治療劑的方法。就其用作治療劑的用途而言，本發(fā)明治療劑具有改進性質(zhì)，特別包括體內(nèi)半壽期、清除率和/或持久性、溶解度和生物利用度中的一種或多種改進性質(zhì)。
【IPC分類】A61P3/10, A61K38/17, A61K38/28
【公開號】CN105727261
【申請?zhí)枴緾N201610101558
【發(fā)明人】A.基爾科蒂
【申請人】杜克大學
【公開日】2016年7月6日
【申請日】2009年6月29日
【公告號】CA2726894A1, CN102131516A, CN102131516B, EP2307038A2, EP2307038A4, EP2926825A1, US8178495, US9127047, US9200083, US20100022455, US20130079277, US20130085099, US20130085104, US20160030521, US20160120952, WO2009158704A2, WO2009158704A3