LDH表達(dá)水平
[0068]
[0069] 在大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎模型中，我們得到了與異丙腎上腺素造急性心肌缺 血模型類似的結(jié)論。冠脈結(jié)扎模型組心肌神經(jīng)氨酸酶活力升高，血清CK_MB、LDH水平上升， 給藥組則顯著性降低。同時(shí)，扎那米韋與奧司他韋給藥能顯著改善大鼠心電圖及心臟病理 切片。
[0070] 實(shí)施例2:黃連堿對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制作用和對(duì)心肌缺血損傷的改善作用
[0071] -、試驗(yàn)材料
[0072] 1、儀器和試劑
[0073] 黃連堿購(gòu)買自四川維克奇生物科技有限公司，純度>98%;其它儀器和試劑同實(shí)施 例1〇
[0074] 2、試驗(yàn)動(dòng)物
[0075]大鼠 100只，來源同實(shí)施例1。
[0076]二、試驗(yàn)方法
[0077] 1、IS0造大鼠急性心肌缺血模型:選取SD大鼠，根據(jù)體重分為空白對(duì)照組、模型組、 黃連堿高劑量組（l〇〇mg/kg p.o.)、黃連堿中劑量組（25mg/kg p.o.)、黃連堿低劑量組 (10mg/kg p.o.)五組，每組10只。給藥組連續(xù)給藥3天，第二天給藥30 min后皮下注射IS0， 劑量為60 mg/kg，第三天同樣給藥30 min后皮下注射ISO,劑量為60 mg/kg，第4天收集血 液、心臟等組織樣本。
[0078] 2、左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎造大鼠急性心肌缺血模型：選取SD大鼠，根據(jù)體重分為 空白對(duì)照組、模型組、黃連堿高劑量組（l〇〇mg/kg p.o.)、黃連堿中劑量組(25mg/kg p.o.)、 黃連堿低劑量組（l〇mg/kg p.o.)五組，每組10只。給藥組預(yù)先24 h和12 h給藥，而后將大鼠 3%水合氯醛10 ml/kg麻醉，仰臥固定于大鼠板上。于左側(cè)4、5肋間切口撕開心包，暴露心 臟，輕壓胸廓擠出心臟，于肺動(dòng)脈圓錐及左心房間找出冠狀動(dòng)脈左前降支，以0號(hào)線立即結(jié) 扎冠狀動(dòng)脈左前降支根部(肺動(dòng)脈圓錐與左心耳處），將心臟送回胸腔，并擠出胸腔內(nèi)血液 和氣體，迅速關(guān)閉胸腔，縫合皮膚，開胸時(shí)間不超過30 s。采用MPA200生物信號(hào)分析系統(tǒng)對(duì) 每只大鼠進(jìn)行心電圖的測(cè)定。造模后24 h收集血液、心臟等組織樣本。
[0079] 3、觀察指標(biāo)及方法
[0080] 3.1記錄心電圖：同實(shí)施例1。
[0081 ] 3.2觀察心臟病理切片：同實(shí)施例1。
[0082] 3.3心肌神經(jīng)氨酸酶水平測(cè)定方法：同實(shí)施例1。
[0083] 3.4血清心肌損傷指標(biāo)CK-MB和D-LDH檢測(cè)方法:同實(shí)施例1。
[0084] 3.5測(cè)定黃連堿對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率
[0085] 用神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定神經(jīng)氨酸酶活力。精密稱取黃連堿標(biāo)準(zhǔn)品，依次配 制200μΜ(高劑量組）、100μΜ(中劑量組）、50μΜ(低劑量組)溶液備用。為配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在96 孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70微升神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)緩沖液，再分別加入0、1、2、5、7.5、10微升 神經(jīng)氨酸酶后每孔加入0-20微升Milli-Q水使每孔總體積為90微升。為檢測(cè)樣品，在96孔熒 光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70微升神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)緩沖液，然后每孔加入10微升神經(jīng)氨酸酶及10 微升不同濃度黃連堿溶液，每孔再加入0-1 〇微升Mi 11 i-Q水使每孔總體積為90微升。振動(dòng)混 勻約1分鐘后37°C孵育2分鐘使抑制劑和神經(jīng)氨酸酶充分相互作用，每孔加入10微升神經(jīng)氨 酸酶熒光底物，振動(dòng)混勻，37°C孵育30分鐘后于激發(fā)波長(zhǎng)322nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm處進(jìn)行熒光 測(cè)定。
[0086]三、試驗(yàn)結(jié)果 [0087] 1、對(duì)心電圖的影響
[0088] 典型心電圖記錄結(jié)果表明：異丙腎上腺素造模后，模型組出現(xiàn)明顯心肌損傷，黃連 堿能有效改善心肌損傷，并呈現(xiàn)劑量依賴性，黃連堿高劑量組的心電圖與空白對(duì)照組基本 一致。
[0089] 2、對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)的影響
[0090] 典型心臟病理切片表明：異丙腎上腺素造模后，模型組出現(xiàn)明顯心肌損傷，表現(xiàn)為 心肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間裂隙明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黃連堿能有效改善心肌損傷， 并呈現(xiàn)劑量依賴性，黃連堿高劑量組的心肌細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間裂隙與空白對(duì)照組基本一 致，且無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
[0091 ] 3、對(duì)心肌神經(jīng)氨酸酶表達(dá)水平的影響
[0092]異丙腎上腺素造模后，ELISA法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞中神經(jīng)氨酸酶表達(dá)，結(jié)果顯示模 型組心肌缺血后神經(jīng)氨酸酶表達(dá)上調(diào)（約40% )，黃連堿能有效抑制心肌缺血引起的神經(jīng)氨 酸酶表達(dá)升高，并呈現(xiàn)劑量依賴性(黃連堿低劑量組比模型組下調(diào)約21%;黃連堿中劑量組 比模型組下調(diào)約29% ;黃連堿高劑量組比模型組下調(diào)約40% )。
[0093] 4、對(duì)心肌損傷指標(biāo)在血清中表達(dá)水平的影響
[0094] CK-MB和D-LDH是心肌缺血損傷的血清標(biāo)志物，異丙腎上腺素造急性心肌缺血模型 后，血清CK-MB、LDH水平上升，給藥組則顯著性降低(黃連堿低劑量組比模型組下調(diào)約20%; 黃連堿中劑量組比模型組下調(diào)約30% ;黃連堿高劑量組比模型組下調(diào)約40% )。
[0095] 5、測(cè)定黃連堿對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率
[0096] 表3為黃連堿對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率，表明黃連堿為神經(jīng)氨酸酶的有效抑制劑，其 對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率呈濃度相關(guān)，黃連堿對(duì)心肌缺血損傷的改善作用可能與黃連堿對(duì)神 經(jīng)氨酸酶的抑制作用有關(guān)。
[0097] 表3黃連堿對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率
[0099]實(shí)施例3:黃連堿與扎那米韋或磷酸奧司他韋對(duì)心肌缺血損傷的協(xié)同改善作用 [0?00] 以Median-effect Principle(中效原理)為評(píng)價(jià)基礎(chǔ)，繪制劑量-效應(yīng)曲線及不同 效應(yīng)下合用指數(shù)曲線(Fa-CI曲線），從兩藥合用指數(shù)的關(guān)系圖表定量評(píng)價(jià)兩藥之間是否存 在協(xié)同關(guān)系。
[0101] 合用指數(shù)ClrDi/Dxi+DVDxdaD^/DxiDx〗，其中Dx1、Dx2為兩藥單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生X效 應(yīng)時(shí)兩藥各自的濃度，DjPD2為兩藥合用時(shí)產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)的兩藥各自所需濃度。黃連堿與扎 那米韋、磷酸奧司他韋作用機(jī)制相同，都是通過抑制神經(jīng)氨酸酶的活性發(fā)揮作用，故a = l。 當(dāng)CI < 1，表明兩藥合用效應(yīng)為協(xié)同；CI = 1，表明兩藥合用效應(yīng)為相加 ;CI > 1表明兩藥合用 效應(yīng)為拮抗。根據(jù)單藥或聯(lián)合用藥對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率，繪制劑量-效應(yīng)曲線，并進(jìn)一步 繪制不同效應(yīng)(Fa)下的合用指數(shù)(CI)關(guān)系曲線。
[0102] 參照實(shí)施例2中"3.5測(cè)定黃連堿對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率"的方法分別測(cè)定不同濃 度黃連堿、扎那米韋、磷酸奧司他韋單藥對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率，以及黃連堿與扎那米韋合 用、黃連堿與磷酸奧司他韋合用對(duì)神經(jīng)氨酸酶的抑制率，繪制劑量-效應(yīng)曲線，并進(jìn)一步繪 制不同效應(yīng)(Fa)下的合用指數(shù)(CI)關(guān)系曲線。兩藥聯(lián)合效應(yīng)分析結(jié)果如下：
[0103] 黃連堿與扎那米韋聯(lián)合作用于神經(jīng)氨酸酶時(shí)，當(dāng)Fa = 0.40(即40%神經(jīng)氨酸酶被 抑制）時(shí)，CI ? 1，兩藥聯(lián)合效應(yīng)為協(xié)同，當(dāng)Fa>0.40時(shí)，CI>1，兩藥合用效應(yīng)為拮抗，當(dāng)Fa< 0.40時(shí)，CI<1，兩藥合用效應(yīng)為協(xié)同。聯(lián)合效應(yīng)分析結(jié)果提示黃連堿與扎那米韋在低劑量 作用于神經(jīng)氨酸酶時(shí)存在協(xié)同作用，進(jìn)一步提示二者在低劑量時(shí)對(duì)心肌缺血損傷存在協(xié)同 改善作用。
[0104] 黃連堿與磷酸奧司他韋聯(lián)合作用于神經(jīng)氨酸酶時(shí)，當(dāng)Fa = 0.45(即45%神經(jīng)氨酸 酶被抑制)時(shí)，CI ? 1，兩藥聯(lián)合效應(yīng)為協(xié)同，當(dāng)Fa>0.45時(shí)，CI > 1，兩藥合用效應(yīng)為拮抗，當(dāng) Fa<0.45時(shí)，CI<1，兩藥合用效應(yīng)為協(xié)同。聯(lián)合效應(yīng)分析結(jié)果提示黃連堿與磷酸奧司他韋 在低劑量作用于神經(jīng)氨酸酶時(shí)存在協(xié)同作用，進(jìn)一步提示二者在低劑量時(shí)對(duì)心肌缺血損傷 存在協(xié)同改善作用。
[0105] 兩藥聯(lián)合效應(yīng)分析結(jié)果表明，可以開發(fā)黃連堿與扎那米韋的組合物或黃連堿與磷 酸奧司他韋的組合物用于治療心肌缺血損傷。由于黃連堿與扎那米韋或黃連堿與磷酸奧司 他韋在低劑量時(shí)存在協(xié)同作用，可以將黃連堿與扎那米韋的組合物或黃連堿與磷酸奧司他 韋的組合物開發(fā)成低劑量規(guī)格的藥物制劑通過反復(fù)給藥實(shí)現(xiàn)改善治療心肌缺血損傷的目 的。
[0106] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 神經(jīng)氨酸酶作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺血損傷的藥物中的應(yīng) 用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述心肌缺血為心肌梗死引發(fā)的心肌缺 血。3. 權(quán)利要求1或2所述的神經(jīng)氨酸酶的抑制劑在制備用于預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺 血損傷的藥物中的應(yīng)用。4. 一種藥物制劑在預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應(yīng)用，其特征在于:包含如 權(quán)利要求3所述的神經(jīng)氨酸酶的抑制劑和藥學(xué)上可以接受的載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑在預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應(yīng)用，其 特征在于:所述神經(jīng)氨酸酶的抑制劑為扎那米韋。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑在預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應(yīng)用，其 特征在于:所述神經(jīng)氨酸酶的抑制劑為磷酸奧司他韋。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑在預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應(yīng)用，其 特征在于:所述神經(jīng)氨酸酶的抑制劑為黃連堿。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑在預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應(yīng)用，其 特征在于:所述神經(jīng)氨酸酶的抑制劑為扎那米韋和黃連堿的組合物。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物制劑在預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的應(yīng)用，其 特征在于:所述神經(jīng)氨酸酶的抑制劑為磷酸奧司他韋和黃連堿的組合物。10. 根據(jù)權(quán)利要求4~9任一所述的藥物制劑在預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺血損傷中的 應(yīng)用，其特征在于:所述心肌缺血為心肌梗死引發(fā)的心肌缺血。
【專利摘要】本發(fā)明公開了神經(jīng)氨酸酶及其抑制劑在心肌缺血及心肌梗死中的應(yīng)用，提供了神經(jīng)氨酸酶與心肌缺血損傷的關(guān)聯(lián)性，證明通過抑制神經(jīng)氨酸酶的活性可以緩解心肌缺血損傷，神經(jīng)氨酸酶可以作為篩選預(yù)防、緩解和/或治療心肌缺血損傷藥物的靶標(biāo)；本發(fā)明還證明了神經(jīng)氨酸酶抑制劑對(duì)心肌缺血損傷的緩解作用，神經(jīng)氨酸酶抑制劑通過降低神經(jīng)氨酸酶的水平改善心肌缺血損傷；本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種藥物制劑，該藥物制劑中含有神經(jīng)氨酸酶抑制劑和藥學(xué)上可以接受的載體，可以用于降低神經(jīng)氨酸酶的水平從而改善心肌缺血損傷。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【IPC分類】A61K31/351, A61K31/4375, A61K38/47, A61K38/55, A61K31/215, A61P9/10
【公開號(hào)】CN105727269
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610166253
【發(fā)明人】齊煉文, 張蕾, 魏婷婷, 范勇
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開日】2016年7月6日
【申請(qǐng)日】2016年3月22日