C)對(duì)樣品中的葡萄糖和木糖含量進(jìn)行 分析。糖的產(chǎn)量(w/v)計(jì)，糖的轉(zhuǎn)化W生物質(zhì)中纖維素和半纖維素的總量為基礎(chǔ)計(jì)算。
[0124] 在某些情況下，對(duì)液體部分和固體部分均補(bǔ)充SO化afloe(S巧生物質(zhì)，W觀察在 兩個(gè)部分中SF的進(jìn)一步水解。向液體部分和固體部分添加SF的原因是為了（i) 了解在固 體殘留物或在液體中的活性纖維素酶的定位和功能屬性；W及（ii)提供證據(jù)表明向固體 殘留物和/或液體中加入的新生物質(zhì)可在不加入任何額外的酶混合物的情況下水解。因 此，SO化afloe在運(yùn)里代表還包含木聚糖的新鮮纖維素生物質(zhì)。So化afloe是用于測(cè)試?yán)w 維素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)的含纖維素生物質(zhì)。與木質(zhì)纖維素生物質(zhì)相比，它是更簡(jiǎn)單的生物質(zhì)；與 微晶纖維素（Avicel)相比，它是均質(zhì)性更低的纖維素制品。So化afloe水解通過(guò)追蹤糖化 過(guò)程中葡萄糖和木糖的釋放提供了測(cè)量葡聚糖和木聚糖轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)。
[0125] 在T= 0、T= 24小時(shí)進(jìn)行采樣。糖化在標(biāo)準(zhǔn)條件下于50°C進(jìn)行。在500血燒瓶 中W100克材料完成實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的糖化。本文提及的貫穿全文的一般糖化工藝如下：用氨 氧化錠水溶液將熱預(yù)處理的生物質(zhì)的抑調(diào)節(jié)至5。然后將該材料與AcceleraseTrio接觸。 通過(guò)W反應(yīng)中葡聚糖的含量、生物質(zhì)的量和生物質(zhì)的固體％為基礎(chǔ)計(jì)算所需的Accelerase 化io的濃度來(lái)確定酶的加入。將充分混合的生物質(zhì)一式S份地轉(zhuǎn)移到SOOmL燒瓶中（各 100gm)用于進(jìn)行糖化。
[0126] 從30加侖罐收集的糖化時(shí)間T=0的生物質(zhì)在24小時(shí)中具有3. 4w/v%的葡萄糖 釋放（"原樣（AsIs)",無(wú)SO化afloe且無(wú)固液分離）。包含作為纖維素酶活性測(cè)試底物 的so化afloe的平行樣品在同樣的糖化時(shí)間內(nèi)將葡萄糖釋放提高到4. 9w/v% (圖5)。此 為葡萄糖釋放增加了 44. 1%。
[0127] 在相同生物質(zhì)的固/液分離之后，在分離的糖化上清液（Sup)和重懸于新鮮水中 的固體部分（沉淀）中觀察葡萄糖釋放。在Sup相24小時(shí)的糖化中，葡萄糖和木糖水平?jīng)] 有變化，表明Sup不包含任何可用于進(jìn)一步糖化的多糖。24小時(shí)后，無(wú)SO化afloe的Sup 具有1.05w/v%的葡萄糖，包含SO化afloe的樣品則增加至1.87%。加入SO化afloe之 后葡萄糖的變化表明Sup包含可W將SO化afloe水解成葡萄糖單體的纖維素酶。 陽(yáng)128] 與T= 0時(shí)的0. 38%比較，未添加SO化afloe的固體殘留物"沉淀"在T= 24的 糖化時(shí)產(chǎn)生高得多的3. 09w/v%的葡萄糖。運(yùn)證明固體殘留物包含高水平的活性纖維素酶， 其即使在將Sup與固體殘留物分離之后仍繼續(xù)糖化生物質(zhì)。包含SO化afloe的固體部分 顯示出葡萄糖的進(jìn)一步釋放，從T= 0時(shí)的0. 41 %至24小時(shí)時(shí)的4. 76% (圖5)，表明固體 關(guān)聯(lián)的纖維素酶對(duì)外源性SO化a-floc底物的活性。
[0129] 運(yùn)些結(jié)果證明，活性纖維素酶與顯示出比未分離的"原樣"樣品更高活性的固體部 分關(guān)聯(lián)（W圖5中的數(shù)據(jù)計(jì)算，葡萄糖釋放增加1. 7倍）。
[0130] 在糖化T= 12小時(shí)采集的"原樣"生物質(zhì)具有3. 32w/v%的葡萄糖，其在24小時(shí) 糖化后達(dá)到3.6%，幾乎未增長(zhǎng)。運(yùn)表明與T=0樣品相比，纖維素酶生產(chǎn)率在"原樣"樣品 中損失。運(yùn)一點(diǎn)通過(guò)在包含SO化a-floc的樣品中較低的C6轉(zhuǎn)化得到確證：從缺少SO化a floe的樣品中3.6w/v%的葡萄糖的基數(shù)，在包含SO化afloe的樣品中糖化24小時(shí)時(shí)達(dá)到 4.6w/v%的葡萄糖。因此，酶對(duì)外源添加的底物的活性比在T= 0采樣點(diǎn)時(shí)低，運(yùn)可能是由 于C6纖維素酶的葡萄糖終產(chǎn)物抑制、不可用的底物或其它因素。 陽(yáng)131] 與來(lái)自于圖5中T=0的樣品的觀察結(jié)果一致，取自T= 12時(shí)間點(diǎn)的Sup(圖6) 通過(guò)加入SO化afloe具有增加的葡萄糖，從3. 32%增加至3. 99% (圖6)，表明Sup包含活 性纖維素酶。固體部分顯示出更高的相對(duì)葡萄糖增加，其中，在24小時(shí)的糖化后，無(wú)SO化a floe的樣品從0. 61w/v%增至1.Ow/v%，具有SO化afloe的樣品從0.6%增至2. 5% (圖 6)O
[0132]圖7示出了從30加侖罐的24小時(shí)糖化材料得到的酶再循環(huán)測(cè)試結(jié)果。在對(duì)照糖 化中，當(dāng)解育另外的24小時(shí)時(shí)，無(wú)SO化afloe的"原樣"生物質(zhì)的葡萄糖釋放幾乎沒(méi)有增 長(zhǎng)。當(dāng)加入SO化afloe時(shí)，葡萄糖從3.6%增加至4. 7% (圖7)，表明酶仍極具活性且與圖 6中的觀察結(jié)果類似。 陽(yáng)133] 在此時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖釋放接近飽和，Sup具有增加的糖濃度（30加侖樣品中的 24小時(shí)糖化材料）。與SO化afloe解育的固體部分仍顯示出葡萄糖釋放的增加，但是小于 12小時(shí)的樣品。運(yùn)表明固體殘留物具有活性纖維素酶，然而24小時(shí)糖化的生物質(zhì)中的可用 多糖較少（圖7)。
[0134]48小時(shí)糖化材料的結(jié)果類似（圖8)，在24小時(shí)糖化之前和之后W及在SO化a floe存在和不存在時(shí)，顯示出類似的葡萄糖水平。
[0135] 運(yùn)些結(jié)果表明，功能性纖維素酶在固體部分中，且直至48小時(shí)仍保持活性W用于 再循環(huán)。 陽(yáng)136] 實(shí)施例2
[0137]早期階段固液分離對(duì)糖化和發(fā)酵的影響。
[0138] 在早期時(shí)間點(diǎn)將Sup從糖化生物質(zhì)中移除，在此之后，對(duì)連續(xù)糖化和發(fā)酵的效率 和可重復(fù)性進(jìn)行了測(cè)定（在T= 4小時(shí)進(jìn)行化巧。圖9顯示了在T=20小時(shí)（總糖化） 內(nèi)，相較于離屯、的固體殘留物和Sup而言，葡萄糖和木糖從生物質(zhì)的釋放。運(yùn)些結(jié)果表明， 相較于未分離的材料（得到3w/v%的葡萄糖），當(dāng)總固體和Sup的葡聚糖轉(zhuǎn)化百分比加在 一起時(shí)，糖釋放更高化34% +1. 63%= 3. 97w/v%的葡萄糖）。
[0139] 在糖化早期進(jìn)行固/液分離，隨后對(duì)各部分繼續(xù)糖化，產(chǎn)生了比未分離的材料更 高的總糖產(chǎn)率。 陽(yáng)140] 實(shí)施例3 陽(yáng)141] 由磨碎糖化和固液分離釋放的糖的發(fā)酵。 陽(yáng)142] 通過(guò)對(duì)糖化生物質(zhì)燈=4小時(shí)糖化）進(jìn)行離屯、將糖化4小時(shí)后的生物質(zhì)分離成 固體部分和液體部分。將具有葡萄糖和其它糖的液體流冷卻至4°C，而對(duì)固體殘留物補(bǔ)充等 體積的新鮮水并糖化另外的12小時(shí)（總糖化時(shí)間為16小時(shí)）。生物質(zhì)中初始慷醒濃度為 900ppm，接近本實(shí)驗(yàn)使用的酵母菌株的可接受發(fā)酵的上限。 陽(yáng)143] 將取自a) 16小時(shí)糖化的生物質(zhì)、b) 12小時(shí)糖化的固體殘留物（總糖化時(shí)間為16 小時(shí)）和C)糖化T= 4小時(shí)分離的Sup的樣品W40XIO6酵母細(xì)胞/gm材料的比例進(jìn)行 接種并發(fā)酵（圖10)。
[0144] 發(fā)酵對(duì)于16小時(shí)糖化的生物質(zhì)和Sup而言是不成功的，但對(duì)于12小時(shí)糖化的固 體殘留物而言是成功的，運(yùn)可能是由于從液體流中除去抑制劑將大部分活性纖維素酶混合 物留在固體部分中。
[0145] 使用具有高慷醒濃度的預(yù)處理的生物質(zhì)的運(yùn)些結(jié)果證明，早期糖化材料的分離使 得來(lái)自固體部分的糖能夠被更有效地發(fā)酵。 陽(yáng)146] 實(shí)施例4 陽(yáng)147] 使用磨碎糖化和固液分離對(duì)>30%的水熱預(yù)處理的生物質(zhì)進(jìn)行的連續(xù)糖化。
[0148] 對(duì)具有>30%的固體％的生物質(zhì)進(jìn)行磨碎和糖化，4小時(shí)后通過(guò)離屯、將其分離成 固體部分和液體部分燈二4)。將具有葡萄糖和其它糖的液體流冷卻至4°C，而對(duì)固體殘留 物補(bǔ)充等體積的新鮮水并糖化另外的16小時(shí)。
[0149] 圖11證明，對(duì)高固體含量的生物質(zhì)的磨碎糖化和固液分離與在較低固體百分比 的生物質(zhì)條件中的情況一樣有效。 陽(yáng)150] 與對(duì)照相比，固相（水補(bǔ)足的）樣品顯示相同的糖化效率，表明在高固體濃度中， 同步磨碎和糖化聯(lián)合固相再循環(huán)系統(tǒng)是有效的。 陽(yáng)151] 實(shí)施例5 陽(yáng)15引 0 -1，4-糖巧鍵（0 -1，4-內(nèi)切葡聚糖酶由此得名）將纖維素的0 -D-化喃葡萄糖 單元連接在一起。0-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶巧G)特異性切割纖維素鏈的內(nèi)鍵。需要外切葡 聚糖酶或纖維二糖水解酶（CBH)、EG和0-葡糖巧酶度G)來(lái)將纖維素完全分解成葡萄糖單 體。在水熱預(yù)處理的玉米賴桿中對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶和0-葡糖巧酶的結(jié)合行為進(jìn)行了測(cè)定， W測(cè)試它們對(duì)葡聚糖轉(zhuǎn)化的作用。 陽(yáng)153] 使用內(nèi)切葡聚糖酶巧G)和0 -葡糖巧酶度G)(由釀酒酵母菌株表達(dá)和分泌）來(lái) 測(cè)試運(yùn)些纖維素酶的結(jié)合性質(zhì)。EGII具有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而B(niǎo)G沒(méi)有。
[0154]將1克水熱預(yù)處理的玉米賴桿與500 y L (30 y g/ y 1)各自濃縮的纖維素酶催化劑 混合并在50°C下對(duì)樣品進(jìn)行解育。在不同時(shí)間點(diǎn)收集上清液，除0. 1%SDS洗涂外，進(jìn)行或 不進(jìn)行緩沖液洗涂。在使用針對(duì)各個(gè)酶催化劑的多克隆抗膚抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡之前，將 上清液用S氯乙酸燈CA)沉淀并用丙酬洗涂。圖12A示出了示意圖，圖12B示出了實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。
[01W] 與在糖化材料的可溶性液體部分中可見(jiàn)的0-葡糖巧酶度G)不同，內(nèi)切葡聚糖酶 巧G)強(qiáng)烈地與固相結(jié)合。 陽(yáng)156] 實(shí)施例6
[0157] 0-葡糖巧酶是作用于連接兩個(gè)葡萄糖或葡萄糖取代分子（即二糖、纖維二糖） 的0-1，4鍵的糖巧酶。它是對(duì)各種P-D-糖巧底物具有特異性的外切纖維素酶。它催化 0 -D-葡糖巧中的末端非還原性殘基的水解，釋放葡萄糖。在預(yù)處理的玉米賴桿中對(duì)0 -葡 糖巧酶度G)的行為進(jìn)行測(cè)試，W評(píng)估早期糖化分離生物質(zhì)中的0-葡糖巧酶的定位和活 性。
[0158] 使用纖維素酶混合物（AccelleraseTrio)對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行糖化，并將其解育4小 時(shí)。將糖化的生物質(zhì)離屯、，并加入等量的新鮮水使生物質(zhì)固體部分標(biāo)準(zhǔn)化。繼續(xù)糖化4小 時(shí)。向各燒瓶中加入纖維二糖（2w/v%)作為外源性底物并解育4小時(shí)。通過(guò)HPLC測(cè)定葡 萄糖和木糖。 陽(yáng)159] 在4小時(shí)后收集糖化生物質(zhì)，并離屯、W分離固體部分和液體部分。液體（上清液） 和固體殘留物均用水標(biāo)準(zhǔn)化，補(bǔ)充W2%的纖維二糖，并于50°C在振蕩解育箱中過(guò)夜解育。[0160] 如下為簡(jiǎn)要圖解：
[0162]圖13示出了上清液和固體部分（用纖維二糖補(bǔ)充）中的葡萄糖生成。BG活性在 上清液和固體殘留物中幾乎同等分布。另外，來(lái)自固體殘留物的液體的兩次隨后替換仍表 現(xiàn)出BG活性。上清液中的BG活性在4小時(shí)內(nèi)達(dá)到飽和。 陽(yáng)163] 運(yùn)個(gè)實(shí)施例表明生物質(zhì)固體部分保留了用于纖維二糖轉(zhuǎn)化的足夠的BG活性。 陽(yáng)164] 實(shí)施例7 陽(yáng)1化]運(yùn)個(gè)實(shí)施例表明本文所述的工藝可W在18小時(shí)內(nèi)將玉米賴桿中80%的葡聚糖轉(zhuǎn) 化成葡萄糖。
[0166] 使用葡聚糖含量為19-40%的玉米賴桿。在140-190°C進(jìn)行水熱預(yù)處理，停留時(shí)間 為30-90分鐘，保持生物質(zhì)固體％ (w/w)的范圍為10%-40%。使用新鮮預(yù)處理的生物質(zhì) 進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)。在糖化開(kāi)始之前，調(diào)節(jié)抑為4-6.5之間。糖化反應(yīng)在磨碎反應(yīng)器中進(jìn)行。糖 化溫度為30-60°C，旋轉(zhuǎn)速度為120-20化pm。臺(tái)式球和/或桿磨碎反應(yīng)器填裝有20-80%的 生物質(zhì)（體積比）并加入纖維素酶混合物。使用商業(yè)化纖維素酶混合物（Ctec2和化ec2; Novozymes，Denmark)進(jìn)行糖化；10% (w/w)的Ctec2加樣是基于生物質(zhì)的葡聚糖含量，而 基于生物質(zhì)的固體％加入0. 5% (w/w)的化ec2。 陽(yáng)167] 生物質(zhì)組成分析：對(duì)生物質(zhì)中的提取物（extractives)進(jìn)行如ASTM方法1107所 述的組成分析。在真空下將液體蒸發(fā)并通過(guò)重量分析測(cè)定提取物含量。制備0.Ig樣品并通 過(guò)標(biāo)準(zhǔn)生物質(zhì)分析方法（NREL)[TAPPI測(cè)試方法（T22-0m88)]中描述的兩階段酸水解法進(jìn) 行表征。第一水解步驟使用72%的硫酸在30°C進(jìn)行1小時(shí)。立即將樣品稀釋至4%并高壓 滅菌1小時(shí)。所得固體殘留物記為酸不溶性木質(zhì)素。水相中的糖通過(guò)高效液相色譜（HPLC) 定量。通過(guò)為每個(gè)糖物類建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)糖樣品進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)葡聚糖、木聚糖和 阿拉伯聚糖含量進(jìn)行定量。使用llOL/gcm的消光系數(shù)，通過(guò)205nm處的UV吸收測(cè)定酸可 溶性木質(zhì)素。通過(guò)在烘箱中于575°C燃燒材料并每4小時(shí)檢查恒重來(lái)測(cè)定灰分含量。
[0168] 在抑調(diào)節(jié)后，向預(yù)處理的玉米賴桿中加入纖維素酶。在酶和生物質(zhì)充分混合后， 對(duì)混合物進(jìn)行磨碎-糖化工藝。在磨碎的T=2和T= 4小時(shí)進(jìn)行化S。在運(yùn)兩種情況下， 總糖化時(shí)間為18小時(shí)。在化SU=2小時(shí)和T= 4小時(shí)）之前W及在18小時(shí)時(shí)記錄葡聚 糖轉(zhuǎn)化％。進(jìn)行粒徑分析并與T=0的生物質(zhì)（在開(kāi)始磨碎-糖化工藝之前剛加入酶的樣 品）相比較（見(jiàn)表1)。計(jì)算了所有測(cè)試樣品的葡聚糖轉(zhuǎn)化速率。
[0169] 表1:磨碎之前和之后材料的粒徑分布
陽(yáng)171] 圖14示出了磨碎過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)材料的粒徑分布。圖15示出了用高剪切磨 碎-糖化聯(lián)合SLS處理的玉米賴桿的葡聚糖向葡萄糖（C6)的轉(zhuǎn)化。在高剪切磨碎條件下 糖化處理僅2小時(shí)、結(jié)合對(duì)固體進(jìn)行另外16小時(shí)的分離后糖化處理（總共18小時(shí)糖化）， 導(dǎo)致80. 6%的葡聚糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖。圖16示出了依照處理和時(shí)間給出的葡聚糖轉(zhuǎn)化速率 (% /小時(shí)）。 陽(yáng)172] 此實(shí)施例表明，在高剪切磨碎條件下糖化僅2小時(shí)、繼W額外糖化16小時(shí)，導(dǎo)致生 物質(zhì)中80 %的葡聚糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖。