一種利用白腐真菌粗酶液降解雙酚a的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用微生物一一白腐真菌粗酶液降 解雙酚A的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙酚A(bisphenol A, BPA)，化學(xué)式為C15H1602，持久性有機(jī)污染物之一，具有"三 致"效應(yīng)。聯(lián)合國(guó)環(huán)境署將其作為繼臭氧層空洞和全球性變暖之后需要亟待治理的第三代 環(huán)境問題提上日程。如何降低這種危害，通過什么樣的方法來降解這類污染物，或者將其轉(zhuǎn) 化為其它無(wú)污染、危害小的化合物是一個(gè)急待解決的科學(xué)難題之一。近年來不斷發(fā)現(xiàn)的物 理吸附和化學(xué)降解法對(duì)環(huán)境中BPA的去除效果良好，但其弊端也顯而易見。物理吸附方法 不涉及BPA的降解，作用簡(jiǎn)單且吸附時(shí)間短，但是由于物理吸附具有可逆性，去除的BPA在 某些條件下可能反吸附，BPA又重新回到反應(yīng)物體系之中，所以物理吸附方法在一定程度上 是不可靠的，它并沒有達(dá)到真正去除的目的?；瘜W(xué)方法降解BPA表現(xiàn)出相當(dāng)高的效率，在催 化條件下甚至可能完全礦化BPA。但是考慮到BPA濃度低于其他常見干擾物濃度，去除至 安全范圍成本高，操作復(fù)雜，另外在處理過程中可能產(chǎn)生二次污染等環(huán)境問題。因此尋求一 種去除效率高、方便、安全且無(wú)污染的去除方法勢(shì)在必行。
[0003] 白腐真菌是一類可以引起木頭腐爛分解的真菌，也是一種重要的環(huán)境污染物降解 真菌。與其它真菌不同，白腐真菌對(duì)BPA的代謝主要依賴于一系列胞外分泌的木質(zhì)素降解 酶（木質(zhì)素過氧化物酶、猛過氧化物酶和漆酶）的作用（Asgher M，Bhatti HN，Ashraf Μ and Legge RL. Recent developments in biodegradation of industrial pollutants by white rot fungi and their enzyme system Biodegradation. 2008,19 :771-783)，因此 其分泌的粗酶液對(duì)雙酚A降解可以表觀白腐真菌本身對(duì)雙酚A的降解。 在傳統(tǒng)的分解雙酚A的方法中，高濃度的雙酚A運(yùn)用比較多的是物理吸附方法，但吸附 存在可逆性，而雙酚A具有低濃度效益，在遠(yuǎn)低于其他常見干擾物濃度仍然有危害作用，故 不能完全吸收較低濃度雙酚A，它并不能達(dá)到真正去除危害的目的；對(duì)于去除濃度低的雙 酚A常常運(yùn)用化學(xué)方法，化學(xué)方法中，去除雙酚A至安全范圍不僅僅需求的化學(xué)試劑量大、 操作步驟比較繁瑣，而且容易在處理過程中可能產(chǎn)生二次污染等環(huán)境問題。
[0004] 基于白腐真菌主要依賴于胞外酶來降解污染物的原理，提出了一種運(yùn)用微生 物一一白腐真菌分解雙酚A的新方法。白腐真菌生長(zhǎng)繁殖快、培養(yǎng)操作較為簡(jiǎn)便。人們?cè)?生活中比較容易獲得白腐真菌，成本比較低廉且綠色安全。白腐真菌分泌的胞外酶相對(duì)含 量較豐富。酶促反應(yīng)具有很高催化特效，綠色安全性而且對(duì)底物濃度要求范圍廣，可以去除 低濃度物質(zhì)，運(yùn)用白腐真菌分解雙酚A可以大大提高分解處理雙酚A類物質(zhì)的效果，其在催 化去除含雙酚A類物質(zhì)的廢水處理技術(shù)上具有突出優(yōu)勢(shì)，能達(dá)到有效地去除環(huán)境污染物修 復(fù)環(huán)境的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)在現(xiàn)有技術(shù)對(duì)BPA降解過程中存在的可逆性，工作量大、成 本高、步驟繁瑣、準(zhǔn)確度低等問題，提供一種利用白腐真菌粗酶液降解雙酚Α的方法。 具體步驟為： (1)制備培養(yǎng)基 向三角瓶?jī)?nèi)加入10. 〇~20. 0克的葡萄糖、1. 0~2. 0克吐溫80、2. 0~3. 0克磷酸二氫鉀、 0· 5~1· 0克硫酸鎂、1. 0~2· 0克氯化鈣、0· 001克維生素 Β1、0· 5~2· 0克氯化鈉、0· 2~1· 0克硫 酸錳和1. 〇~3. 0 mL微量元素混合溶液，定容至0. 05~1. 5升，在1. 103MPa、121°C條件下滅 菌20分鐘，制得限氮液體培養(yǎng)基備用。
[0006] (2)白腐真菌粗酶液的制備 按照體積比為1:9量取孢子懸液和步驟（1)制得的限氮液體培養(yǎng)基，將孢子懸液接種 于限氮液體培養(yǎng)基中，在25~40°C、100~200轉(zhuǎn)/分鐘的條件下置于振蕩培養(yǎng)箱中懸浮培 養(yǎng)5~7天，所得培養(yǎng)液在燒杯中緩緩研磨，破碎后得到的細(xì)胞勻漿培養(yǎng)液經(jīng)冷凍離心機(jī)在 4°C、8000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心5~15分鐘，取上清液，然后用無(wú)菌的0. 45 μπι濾膜過濾， 過濾后的濾液置于半透膜中，室溫取流動(dòng)水透析12小時(shí)，然后分子量ΙΟ-kDa超濾濃縮，得 到的透析液即為白腐真菌粗酶液，置于4°C的冰箱中保存，備用。
[0007] (3)雙酚A的降解 稱取1.0~3.0 mL濃度為250 mmol/L的酒石酸緩沖液加入準(zhǔn)備好的已滅菌的三角燒瓶 中，然后置于20~50°C恒溫水浴中，再加入1. 0~3. OmL步驟（2)制得的白腐真菌粗酶液、5mL 濃度為〇. 20mmol/L的雙酚A溶液、0. 5~2. OmL濃度為0. 3~0. 5mmol/L的雙氧水和藜蘆醇， 控制反應(yīng)體系的pH值為2. 5~3,反應(yīng)體系中藜蘆醇濃度為10mmol/L，反應(yīng)30~50分鐘，加 入1. 0~3. OmL甲醇終止反應(yīng)，即實(shí)現(xiàn)利用白腐真菌粗酶液降解雙酚A。
[0008] 本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)處理雙酚A的手段和效果，白腐真菌依靠胞外酶降解環(huán)境污 染物的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種運(yùn)用白腐真菌分泌酶對(duì)雙酚A降解的方法。在本方法中，所選取的 處理材料僅為微生物，生長(zhǎng)繁殖快、方便取用、成本低廉，生物酶具有高效催化能力。此外， 操作較為簡(jiǎn)便，而且成本比較低，不易造成二次的污染。
【附圖說明】
[0009] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中白腐真菌粗酶液催化降解雙酚A的降解率隨溫度的變化情 況。
[0010] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中白腐真菌粗酶液催化降解雙酚A的降解率隨pH值的變化 情況。
[0011] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中白腐真菌粗酶液催化降解雙酚A的降解率隨啟動(dòng)劑雙氧水 濃度的變化情況。
[0012] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例中藜蘆醇的添加對(duì)白腐真菌粗酶液降解雙酚A的影響情況。
[0013] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例中白腐真菌粗酶液催化降解雙酚A中加藜蘆醇和不加藜蘆醇 時(shí)降解率的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 為了使本專利實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與作用更加清楚及易于了解， 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本專利作進(jìn)一步闡述，所列實(shí)施例僅在于說明本發(fā)明而 不限制本發(fā)明。
[0015] 本實(shí)施例中使用的微量元素混合溶液含：3. 0g MgS04· 7H20，1.0g NaCl，0. lg CaCI2 · 2Η20,0· lg FeS04 · 7Η20,0· lg C〇S04,0.0 lg A1K(S04)2 · 12Η20,0· lg ZnS04 · 7H20， 0· Olg CuS04 · 5H20,0.0 lg H3B03和 0· Olg Na 2Mo04 · 2H20。
[0016] ⑴制備培養(yǎng)基 向三角瓶?jī)?nèi)加入10克的葡萄糖、1. 〇克吐溫80、2. 56克磷酸二氫鉀、0. 71克硫酸鎂、 1. 56克氯化鈣、0. 001克維生素隊(duì)、1. 0克氯化鈉、0. 5克硫酸錳和2. 0 mL微量元素混合溶 液，定容至1. 0升，在1. l〇3MPa、121°C條件下滅菌20分鐘，制得限氮液體培養(yǎng)基備用。
[0017] ⑵白腐