本實用新型涉及一種用于定位試樣中的點(diǎn)狀樣本的光學(xué)顯微方法，按照該方法，借助成像鏡頭使得設(shè)置在樣本空間中的試樣成像到探測器上，該成像鏡頭在樣本空間中沿著其光軸具有預(yù)定軸向延展距離的清晰深度區(qū)域，在清晰深度區(qū)域內(nèi)對在試樣中含有的點(diǎn)狀樣本定位，其方式為，對因試樣成像到探測器上而產(chǎn)生的第一試樣圖像加以分析，其中，為了在光軸方向上定位相應(yīng)的點(diǎn)狀樣本，求取第一試樣圖像的表示點(diǎn)狀樣本的光斑的特征參數(shù)，并根據(jù)預(yù)定的指配信息給該特征參數(shù)指配涉及點(diǎn)狀樣本的軸向位置。

背景技術(shù)：

近來研發(fā)出了光學(xué)顯微成像法，采用這種方法可以基于對各個標(biāo)記特別是熒光分子的順序的隨機(jī)的定位來顯示比傳統(tǒng)的光學(xué)顯微術(shù)的由運(yùn)動引起的分辨率極限更小的試樣結(jié)構(gòu)。這種方法例如記載在WO 2006/127692 A2；DE 10 2006 021 317 B3；WO 2007/128434 A1、US 2009/0134342 A1；DE 10 2008 024 568 A1；WO 2008/091296 A2；“Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)(采用隨機(jī)光學(xué)重建顯微法(STORM)的子衍射極限成像)”，Nature Methods(自然，方法)3，793-796(2006)，M.J.Rust，M.Bates，X.Zhuang；“Resolution of Lambda/10in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching(在采用幾乎單分子光切換的熒光顯微術(shù)中的λ/10分辨率)”，Geisler C.等人，Appl.Phys.A，88,223-226(2007)中。顯微術(shù)的這種新分支也稱為定位顯微術(shù)。所采用的方法在例如名為(F)PALM((Fluorescence)Photoactivation Localization Microscopy)、PALMIRA(PALM with Independently Running Acquisition)、GSD(IM)(Ground State Depletion Individual Molecule Return)Microscopy)或(F)STORM((Fluorescence)Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)的文獻(xiàn)中已知。

這些新方法的共同點(diǎn)是，制備要成像的帶有點(diǎn)狀樣品即所謂的標(biāo)記的試樣結(jié)構(gòu)，這些標(biāo)記具有兩個可區(qū)分開的狀態(tài)，即“亮”態(tài)和“暗”態(tài)。如果例如使用熒光顏料作為標(biāo)記，則亮態(tài)就是能夠發(fā)熒光的狀態(tài)，而暗態(tài)就是不能發(fā)熒光的狀態(tài)。

在優(yōu)選的實施方式中，例如在WO 2008/091296 A2和WO 2006/127692 A2中，使用了可光切換或可光激活的熒光分子。替代地，如在DE 10 2006 021 317 B3中，可以使用標(biāo)準(zhǔn)熒光分子的固有的暗態(tài)。

為了以高于成像鏡頭的傳統(tǒng)的分辨率極限的分辨率來對試樣結(jié)構(gòu)予以成像，現(xiàn)在重復(fù)地將小部分量的標(biāo)記轉(zhuǎn)變?yōu)榱翍B(tài)。在此，在最簡單的情況下，適當(dāng)?shù)剡x擇形成這些激活的部分量的標(biāo)記的密度，使得在亮態(tài)下進(jìn)而在可采用光學(xué)顯微術(shù)成像的狀態(tài)下相鄰標(biāo)記的平均距離大于成像鏡頭的分辨率極限。形成激活的部分量的那些標(biāo)記被成像在有空間分辨性的光學(xué)探測器例如CCD攝像機(jī)上，從而由每個點(diǎn)狀標(biāo)記檢測光斑形式的光分布，所述光斑的大小由鏡頭的分辨率極限確定。

通過這種方式來攝取多個原初數(shù)據(jù)-單圖像，在這些圖像中分別成像了另一個激活的部分量。然后在圖像分析過程中，在每個原初數(shù)據(jù)-單圖像內(nèi)確定光分布的重心位置，其顯示出處于亮態(tài)的點(diǎn)狀標(biāo)記。由原初數(shù)據(jù)-單圖像求取的那些光分布重心位置然后在整個顯示中以整個圖像-數(shù)據(jù)組的形式被匯總。通過該整個顯示產(chǎn)生的高分辨率的整個圖像反映了標(biāo)記的分布。

為了有代表性地反映要成像的試樣結(jié)構(gòu)，必須探測足夠多的標(biāo)記信號。但由于在激活的各部分量中標(biāo)記的數(shù)量受限于兩個標(biāo)記在亮態(tài)下相互間必須具備的最小的平均距離，所以必須攝取很多原初數(shù)據(jù)-單圖像，以便完全對試樣結(jié)構(gòu)予以成像。原初數(shù)據(jù)-單圖像的數(shù)量通常處于10000-100000的范圍內(nèi)。

除了按上述在樣本平面(下面也稱為x-y平面)上對標(biāo)記進(jìn)行橫向的位置確定外，也可以在軸向(下面稱為z方向)上進(jìn)行位置確定。軸向在此系指在成像鏡頭的光軸上的方向，即光的主要傳播方向。

三維的定位由所謂的“粒子追蹤”實驗已知，比如在Kajo等人，1994，Biophysical Journal，67、Holtzer等人，2007，Applied Physics Letters，90和Toprak等人，2007，Nano Letters，7(7)中有所記載。所述定位也已經(jīng)應(yīng)用在圖像產(chǎn)生方法中，這些方法基于上述對單分子的切換和定位。為此參見Huang等人，2008，Science，319和Juette等人，2008，Nature Methods。對于現(xiàn)有技術(shù)，還參見Pavani等人，2009，PNAS，106。

在z方向上對點(diǎn)狀樣本的定位在原則上可以采用如下方式來進(jìn)行：對在攝像機(jī)的探測面上檢測到的光斑的變化加以分析，當(dāng)點(diǎn)狀樣本從在光學(xué)方面變成探測面的清晰平面或聚焦平面移出時就能看到這種變化。在此，點(diǎn)狀樣本在下文中系指一種樣本，其尺寸小于成像鏡頭特別是探測物鏡的由衍射引起的分辨率極限。在這種情況下，探測物鏡使得這種樣本以三維聚焦光分布的形式在圖像空間中成像。該聚焦光分布在攝像機(jī)的探測面上產(chǎn)生光斑，該光斑通過所謂的“點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)”即點(diǎn)成像函數(shù)或簡寫為PSF來表征。如果現(xiàn)在點(diǎn)狀樣本在通過焦點(diǎn)的z方向上即垂直于清晰平面移動，PSF的大小和形狀就會改變。如果在PSF的大小和形狀方面分析與所檢測的光斑相應(yīng)的探測信號，就能由此推斷出樣本的實際z位置。

如果點(diǎn)狀樣本離開清晰平面太遠(yuǎn)，在攝像機(jī)的探測面上產(chǎn)生的光斑就會模糊不清，從而在通常的測量噪聲內(nèi)無法再感知到相應(yīng)的測量信號。因而在樣本空間內(nèi)在z方向上有個圍繞中央的聚焦平面或清晰平面的區(qū)域，在這個區(qū)域內(nèi)，點(diǎn)狀樣本在探測面上產(chǎn)生光斑，該光斑仍足夠清晰，以便能夠被利用來在z方向上定位點(diǎn)狀樣本。在z方向上的含有清晰平面的這個區(qū)域在下文中稱為“清晰深度區(qū)域”。

然而在三維定位時存在一個基本問題：由點(diǎn)狀樣本引起的PSF關(guān)于探測面是對稱的。這意味著，雖然在點(diǎn)狀樣本從清晰平面中移出時PSF發(fā)生改變，從而可以確定點(diǎn)狀樣本相距清晰平面的間距，但是，PSF的變化在清晰平面的兩側(cè)是對稱的，因而無法判定點(diǎn)狀樣本在清晰深度區(qū)域內(nèi)處于清晰平面的哪一側(cè)。

已知有各種不同的可以用來解決上述問題的方法。這些方法在本領(lǐng)域內(nèi)例如有“Astigmatismusverfahren(散光法)”(上述文獻(xiàn)Kajo等，Holtzer等人和Huang等人)、“Bi-Plane-Verfahren(雙平面法)”(參見Toprak等和Juette等)和“Doppelhelixverfahren(雙螺旋法)”(參見Pavani等)。這些方法的共同點(diǎn)是，為了在z方向上定位點(diǎn)狀樣本，對在探測器上產(chǎn)生的光斑加以分析，以便確定特征參數(shù)，并給該特征參數(shù)指配點(diǎn)狀樣本的z位置。這種指配借助于事先確定的指配信息來進(jìn)行，所述指配信息使得特征參數(shù)與點(diǎn)狀樣本的z位置相關(guān)。作為特征參數(shù)，比如在散光法中考慮能表征光斑形狀的參數(shù)，或者，比如在雙平面方法的情況下，考慮能使得兩個光斑的延展距離彼此相關(guān)的參數(shù)，這些光斑來自于同一個光斑且由探測面產(chǎn)生，這些光斑的指配的清晰平面在樣本空間內(nèi)在z方向上彼此錯開。

現(xiàn)在問題在于，在真正的光學(xué)顯微測量之前確定的指配信息往往不準(zhǔn)確，因而無法準(zhǔn)確地確定z位置，所述指配信息能實現(xiàn)在測量中求取的特征參數(shù)與點(diǎn)狀樣本的軸向z位置之間的指配。指配信息因而與試樣的光學(xué)特性的變化有關(guān)。對于定位顯微術(shù)中所需要的大功率鏡頭而言，光學(xué)特性的微小變化就已經(jīng)導(dǎo)致成像錯誤，例如導(dǎo)致球形的像差。這造成由光斑產(chǎn)生的PSF的形狀發(fā)生改變，例如以校準(zhǔn)曲線形式求取的指配信息因而對于新的光學(xué)條件來說不再正確。在這種情況下，給在探測器上檢測到的光斑指配錯誤的z位置。

對于使用者來說，往往難以在最終要予以測量的生物試樣中施加能用來產(chǎn)生上述校準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)件，比如發(fā)熒光的小球。尤其是當(dāng)這些校準(zhǔn)件為了避免因色像差所致的錯誤而要以不同的顏色發(fā)熒光時就是這種情況。因此，在實踐中優(yōu)選的方案是，以自己的校準(zhǔn)試樣進(jìn)行校準(zhǔn)，即確定指配信息。然而在這里，錯誤校準(zhǔn)的問題有很大影響，因為校準(zhǔn)試樣的光學(xué)特性從來都不與真正的測量試樣的光學(xué)特性一致。蓋片玻璃厚度方面的微小差異或者試樣嵌入介質(zhì)方面的微小差異就已經(jīng)會導(dǎo)致校準(zhǔn)曲線形狀的顯著偏差。

即使直接在要測量的試樣中以巨大的試驗代價開設(shè)出校準(zhǔn)試樣，如此得到的校準(zhǔn)曲線也可能有誤。因此，微小的溫度變化例如就已經(jīng)導(dǎo)致通常的浸漬油改變其折射系數(shù)，這又 造成在成像中出現(xiàn)球形的像差。因而即使在同一個試樣中也可能在校準(zhǔn)試樣攝取時間點(diǎn)與真正的測量的時間點(diǎn)之間出現(xiàn)校準(zhǔn)曲線變化。此外，用作校準(zhǔn)試樣的一定大小的熒光小球的信號始終不同于形成點(diǎn)狀樣本的單分子的信號，這又導(dǎo)致了有錯誤的校準(zhǔn)曲線。

在實踐中，這些問題導(dǎo)致往往無法絕對精確地確定點(diǎn)狀樣本的z位置。因此，雖然完全可以確定z位置方面的相對差異，進(jìn)而也能以高的分辨率區(qū)分開相鄰的結(jié)構(gòu)，但難以判斷可能的相鄰的結(jié)構(gòu)相互間的距離到底有多遠(yuǎn)。在此重要的是，在分辨率與絕對的位置確定之間進(jìn)行區(qū)分，所述分辨率即為將緊密相鄰的結(jié)構(gòu)彼此分開的可能性。因此，現(xiàn)有技術(shù)中所采用的例如校準(zhǔn)曲線形式的指配信息雖然通常能實現(xiàn)所希望的分辨率，卻無法精確地確定點(diǎn)狀樣本的絕對的z位置。這種情況也可以稱為三維圖像在z方向上嚴(yán)重的(通常為非線性的)失真，這種失真由光學(xué)像差引起。恰恰在現(xiàn)代生物學(xué)中，這是個很大的問題。因此，例如蛋白質(zhì)(Protein)的確切形態(tài)及布置方式顯著地影響著其工作方式。因此，為了得到關(guān)于結(jié)構(gòu)布置的信息，轉(zhuǎn)而要在全部的三個空間方向上都進(jìn)行精確的且絕對的測量。而在現(xiàn)有技術(shù)中存在的用于在z方向上定位的不足的校準(zhǔn)方案無法允許實現(xiàn)足夠的可靠性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本實用新型的目的因此是，對開篇所述類型的用于定位點(diǎn)狀樣本的光學(xué)顯微方法加以改進(jìn)，從而可以在z方向上相比于目前更為精確地定位點(diǎn)狀樣本。

本實用新型揭示了一種用于定位試樣中的點(diǎn)狀樣本的光學(xué)顯微機(jī)構(gòu)，帶有：成像鏡頭，其在樣本空間中沿著其光軸(O)具有預(yù)定軸向延展距離(t)的清晰深度區(qū)域；探測器，成像鏡頭把設(shè)置在樣本空間內(nèi)的試樣成像到該探測器上；和控制單元，該控制單元在清晰深度區(qū)域內(nèi)部對試樣中含有的點(diǎn)樣樣本予以定位，其方式為，成像鏡頭在探測器上產(chǎn)生第一試樣圖像，該控制單元分析該第一試樣圖像；其中，為了在光軸(O)的方向上定位相應(yīng)的點(diǎn)狀試樣，控制單元求取第一試樣圖像的表示點(diǎn)狀樣本的光斑的特征參數(shù)(d)，并根據(jù)預(yù)定的指配信息給該特征參數(shù)指配涉及點(diǎn)狀樣本的軸向的z位置，其特征在于，在清晰深度區(qū)域內(nèi)對點(diǎn)狀樣本進(jìn)行定位，受控制單元控制的移調(diào)單元使得該清晰深度區(qū)域在樣本空間內(nèi)相對于試樣沿著光軸(O)移動預(yù)定的軸向移調(diào)路程，該移調(diào)路程小于清晰深度區(qū)域的軸向延展距離(t)；在清晰深度區(qū)域軸向地移動時，成像鏡頭使得試樣重新成像到探測器上，并產(chǎn)生第二試樣圖像；控制單元在該第二試樣圖像中根據(jù)預(yù)定的軸向移調(diào)路程來求取點(diǎn)狀樣本的z位置；控制單元把點(diǎn)狀樣本的在第一試樣圖像中求取的z位置與同一點(diǎn)狀樣本的在第二試樣圖像中求取的z位置相比較；控制單元根據(jù)這種比較來產(chǎn)生矯正信息，控制單元借助于該矯正信息對點(diǎn)狀樣本的根據(jù)指配信息求取的z位置予以矯正。，

本實用新型實現(xiàn)該目的的方式為，在清晰深度區(qū)域內(nèi)對點(diǎn)狀樣本進(jìn)行定位，該清晰深 度區(qū)域在樣本空間內(nèi)相對于試樣沿著光軸移動預(yù)定的軸向移調(diào)路程，該移調(diào)路程小于清晰深度區(qū)域的軸向延展距離；在清晰深度區(qū)域軸向地移動時，試樣借助于成像鏡頭重新成像到探測器上，并產(chǎn)生至少一個第二試樣圖像；在該第二試樣圖像中根據(jù)預(yù)定的軸向移調(diào)路程來求取點(diǎn)狀樣本的z位置；把點(diǎn)狀樣本的在第一試樣圖像中求取的z位置與同一點(diǎn)狀樣本的在第二試樣圖像中求取的z位置相比較；根據(jù)這種比較來產(chǎn)生矯正信息，借助于該矯正信息對點(diǎn)狀樣本的根據(jù)指配信息求取的z位置予以矯正。

如開篇已述，根據(jù)本實用新型的在樣本空間內(nèi)的清晰深度區(qū)域系指在z方向上的在中央的聚焦平面或清晰平面周圍的區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)部，點(diǎn)狀樣本在探測器上產(chǎn)生一個光斑，該光斑仍足夠清晰，以便能夠被利用來在z方向上定位點(diǎn)狀樣本。在此無需完全用盡 該最大可能的清晰深度區(qū)域。因而可以有利地根據(jù)所希望的定位精度來有意識地縮小清晰深度區(qū)域，進(jìn)而可以從分析中提取出已經(jīng)很模糊不清的但本身仍可利用的光斑。

本實用新型的方案規(guī)定，在測量期間對可能由于光學(xué)成像錯誤所致的有誤的指配信息予以矯正，所述指配信息例如以存儲的校準(zhǔn)函數(shù)的形式存在。為此使得成像鏡頭的清晰深度區(qū)域相對于試樣移動一段軸向的移調(diào)路程，所述清晰深度區(qū)域的沿著光軸的軸向延展距離是已知的，所述移調(diào)路程小于清晰深度區(qū)域的軸向延展距離。換句話說，這種移動適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，從而在樣本空間內(nèi)在最初的清晰深度區(qū)域與移動了的清晰深度區(qū)域之間沿著光軸存在一定的重疊。

這種重疊因而按下述方式實現(xiàn)：清晰深度區(qū)域沿著光軸移動的軸向移調(diào)路程小于清晰深度區(qū)域的軸向延展距離。因此，該移調(diào)路程例如處于清晰深度區(qū)域的軸向延展距離的5％-90％、10％-80％、15％-70％、20％-60％或25％-50％的范圍內(nèi)。不言而喻，這些值范圍僅僅是示范性的。

根據(jù)本實用新型，使得清晰深度區(qū)域移動一段小于清晰深度區(qū)域的軸向延展距離的軸向移調(diào)路程，這應(yīng)理解為，所考察的兩個清晰深度區(qū)域即最初的清晰深度區(qū)域和移動了的清晰深度區(qū)域沿著光軸有重疊。這意味著，本實用新型也覆蓋清晰深度區(qū)域的移動的一組步驟，按照該組步驟，在一個單獨(dú)的步驟中，清晰深度區(qū)域移動一段大于清晰深度區(qū)域的延展距離的移調(diào)路程，只要該組步驟在總體上導(dǎo)致在所考察的清晰深度區(qū)域之間實現(xiàn)前述的軸向重疊。

清晰深度區(qū)域以一個或多個步驟在樣本空間內(nèi)移動的軸向移調(diào)路程小于清晰深度區(qū)域的軸向延展距離，這種情況意味著，清晰深度區(qū)域在z方向上的移動以一精度進(jìn)行，該精度超過成像鏡頭的在z方向上的分辨率精度。這例如可以通過一種壓電執(zhí)行器來實現(xiàn)，該壓電執(zhí)行器要么使得成像鏡頭要么使得試樣在z方向上移動。同樣可行的是，為了移動清 晰深度區(qū)域，使用合適的光學(xué)器件，例如可變形的透鏡、可變形的或可移動的反射鏡或立體的光調(diào)制器。

根據(jù)本實用新型的矯正能實現(xiàn)超出清晰深度區(qū)域進(jìn)行三維的顯微成像，這在以前由于圖像在z方向上失真而無法直截了當(dāng)?shù)貙崿F(xiàn)。雖然在原則上即使針對通常的方法也可考慮在攝取一個圖像之后使得該圖像在z方向上精確地移動一個與清晰深度區(qū)域的軸向延展距離相等的量值，然后攝取另一個圖像，以便最后把這兩個圖像在z方向上組合起來，這樣就可得到一個在z方向上延伸經(jīng)過兩個清晰深度區(qū)域的總圖像，但這種做法卻要求在z方向上以一精度對點(diǎn)狀樣本進(jìn)行定位，而該精度在以前是無法達(dá)到的。采用本實用新型的方法實現(xiàn)的精度才允許在z方向上把多個圖像組合起來，而不會在圖像之間出現(xiàn)錯誤的重疊或空隙。

如果用來矯正點(diǎn)狀樣本的z位置的矯正信息以矯正規(guī)則的形式被提供，根據(jù)本實用新型采用該矯正規(guī)則給點(diǎn)狀樣本的利用最初的(錯誤的)指配信息求取的z位置指配經(jīng)矯正的z位置，那么，有時在前述情況下為每個在z方向上相繼的清晰深度區(qū)域都要求取一個自己的矯正規(guī)則，并應(yīng)用于在該清晰深度區(qū)域中對點(diǎn)狀樣本定位。

本實用新型的方法尤其在如下情況下可得到卓有成效的應(yīng)用：校準(zhǔn)曲線可通過試樣或經(jīng)過試樣的光路的光學(xué)特性的變化而改變。因而可以有不同的校準(zhǔn)適用于試樣的不同的區(qū)域。這樣的例子有浸在水狀介質(zhì)中的試樣。成像的清晰深度區(qū)域浸入到試樣中越深，光就必須穿過越多的水，水具有不同于其它光學(xué)材料比如浸漬油和玻璃的折射系數(shù)。因此，光學(xué)圖像進(jìn)而校準(zhǔn)曲線也根據(jù)清晰深度區(qū)域的z位置而改變。

根據(jù)本實用新型，第一或第二試樣圖像分別是圖像數(shù)據(jù)組，該圖像數(shù)據(jù)組例如通過開篇所述的原初數(shù)據(jù)-單圖像來實現(xiàn)。

優(yōu)選在清晰深度區(qū)域內(nèi)部沿著光軸規(guī)定至少一個相對于清晰深度區(qū)域偏移的z偏差位置。由至少一個在清晰深度區(qū)域軸向移動后在探測器上產(chǎn)生的第二試樣圖像構(gòu)成一些光斑，這些光斑形成了在軸向移動的清晰深度區(qū)域中布置在z參考位置的點(diǎn)狀樣本，把所述光斑中的至少一個規(guī)定為參考光斑。用參考光斑表示的點(diǎn)狀樣本的z位置在樣本空間內(nèi)根據(jù)清晰深度區(qū)域的軸向移調(diào)路程和z參考位置來確定。第一試樣圖像形成了與第二試樣圖像的參考光斑相同的點(diǎn)狀樣本，由該第一試樣圖像構(gòu)成的光斑之一被確定為比較光斑。根據(jù)由比較光斑形成的點(diǎn)狀樣本的z位置相對于由參考光斑形成的同一點(diǎn)狀樣本的z位置的偏差，產(chǎn)生矯正信息，利用該矯正信息來矯正點(diǎn)狀樣本的根據(jù)指配信息求取的z位置。

因而在清晰深度區(qū)域內(nèi)部規(guī)定了至少一個相對于清晰深度區(qū)域偏移的z參考位置。后者意味著，z參考位置與清晰深度區(qū)域一樣地在樣本空間內(nèi)移動。例如可以把清晰深度區(qū)域的在樣本空間內(nèi)的軸向上邊界或軸向下邊界規(guī)定為z參考位置。清晰深度區(qū)域的中央的清 晰平面所在的z位置也適宜作為z參考位置。此外可行的是，在清晰深度區(qū)域內(nèi)部并非僅規(guī)定一個唯一的z參考位置，而是規(guī)定多個z參考位置，它們在樣本空間內(nèi)的位置是已知的，因而能實現(xiàn)無誤地確定位于z參考位置的點(diǎn)狀樣本的z位置。

該實施方式因而規(guī)定，清晰深度區(qū)域的不受光學(xué)成像錯誤影響的精確的移動被利用來在當(dāng)前測量期間例如以一定的時間間隔在試樣中進(jìn)行參考測量，借助于這些參考測量可以對錯誤的校準(zhǔn)予以矯正。這種矯正的依據(jù)是，在清晰深度區(qū)域軸向地移動后攝取的試樣圖像中，可以無誤地確定在移動了的清晰深度區(qū)域內(nèi)部位于z參考位置的那些點(diǎn)狀樣本，因為所述z參考位置是已知的。根據(jù)本實用新型，在知道這些正確的z位置情況下，可以產(chǎn)生矯正信息，所述矯正信息于是可以用來在清晰深度區(qū)域移動之前攝取的試樣圖像中對點(diǎn)狀樣本的在該試樣圖像內(nèi)求取的z位置予以矯正。如果通過清晰深度區(qū)域的連續(xù)移動使得矯正信息逐漸完善，就可以采用這種方式對整個圖像的因錯誤的校準(zhǔn)引起的失真予以矯正。

優(yōu)選使得清晰深度區(qū)域按多個步驟軸向地移動。于是在這些步驟的任一步驟中都借助相應(yīng)的參考光斑和相應(yīng)的比較光斑來產(chǎn)生矯正信息。最后，借助逐步地產(chǎn)生的矯正信息對點(diǎn)狀樣本的根據(jù)指配信息求取的z位置予以矯正。通過清晰深度區(qū)域的逐步移動，最初的即未移動的清晰深度區(qū)域同z參考位置一起被掃描。由于z參考位置在每一步驟中都是已知的，所以可以在最初的清晰深度區(qū)域內(nèi)部，對在與分別移動的z參考位置重疊的z位置上確定的那些點(diǎn)狀樣本予以精確定位。于是基于這些精確地確定的z位置，借助矯正信息也可以求取在最初的清晰深度區(qū)域內(nèi)部的位于這些位置之間的z位置。

優(yōu)選在每個步驟中都用針對相應(yīng)的參考光斑求取的z位置來代替根據(jù)指配信息針對相應(yīng)的比較光斑求取的z位置，并通過這種代替來產(chǎn)生形成矯正信息的矯正函數(shù)。在此，該矯正函數(shù)優(yōu)選覆蓋已用來攝取第一試樣圖像的整個清晰深度區(qū)域。

按照一種特別優(yōu)選的設(shè)計，通過插值法來求取矯正函數(shù)的中間值，對于這些中間值來說，通過清晰深度區(qū)域的逐步移動并無比較光斑和參考光斑可供使用。在這種情況下，通過z參考位置的移動精確地求取的z位置形成了取值點(diǎn)，基于這些取值點(diǎn)可以進(jìn)行插值，例如進(jìn)行簡單的樣條插值。因而例如選擇合適的對通常的校準(zhǔn)錯誤予以考慮的模型函數(shù)，該模型函數(shù)與前述取值點(diǎn)適配，以便得到所希望的矯正函數(shù)。

點(diǎn)狀樣本的通過清晰深度區(qū)域的逐步移動求取的z位置優(yōu)選重疊成總的定位圖像。因此，(第二)試樣圖像并非僅僅用來矯正在最初的(第一)試樣圖像中求取的z位置，而且用來產(chǎn)生總的定位圖像，其在z方向上延伸經(jīng)過比最初的清晰深度區(qū)域大的區(qū)域。

清晰深度區(qū)域在樣本空間內(nèi)移動的軸向移調(diào)路程優(yōu)選借助于傳感器來檢測。由此確保在對點(diǎn)狀樣本的所求取的z位置進(jìn)行矯正中予以考慮的軸向移調(diào)路程始終都精確地已知。清晰深度區(qū)域相對于試樣的移動可以按下述方式進(jìn)行：要么使得試樣相對于成像鏡頭要么 使得成像鏡頭相對于試樣沿著光軸移動。但本實用新型并不局限于此。因而例如也可以使用可變形的透鏡、可變形的反射鏡、立體的光調(diào)制器等，以便使得清晰深度區(qū)域在樣本空間內(nèi)沿著成像鏡頭的光軸移動。

在一種特殊的實施方式中，使用一種置于探測器之前的柱形透鏡，該柱形透鏡導(dǎo)致在探測器上產(chǎn)生的光斑的可區(qū)分的形狀變化，如果指配于該光斑的點(diǎn)狀樣本沿著光軸從位于清晰深度區(qū)域內(nèi)的清晰平面的一側(cè)移動至其另一側(cè)。光斑的形狀變化于是可以用作在z方向上進(jìn)行定位之用的特征參數(shù)。

這里需要指出，術(shù)語“光斑的形狀”根據(jù)本實用新型系指，它不僅具有單光斑的形狀，而且包括由多個光斑構(gòu)成的整體的形狀，這種整體比如在開篇所述的雙螺旋方法中提到過。在那里例如考察了兩個光斑，這些光斑同樣進(jìn)行相互間的相對旋轉(zhuǎn)運(yùn)動。

通過比較光斑形成的比較結(jié)構(gòu)優(yōu)選在考慮其亮度的情況下來確定，即在考慮有助于該結(jié)構(gòu)的單光斑總數(shù)的情況下確定。該實施方式尤其是當(dāng)在清晰深度區(qū)域移動時求取的z位置不僅用于矯正事先借助指配信息確定的z位置，而且被考慮用于產(chǎn)生總的定位圖像時是有利的。通過該改進(jìn)方案來避免在總的定位圖像中有干擾性的亮度差異。

指配信息的獲取方式例如可以為，使得校準(zhǔn)點(diǎn)狀樣本在清晰深度區(qū)域內(nèi)部沿著光軸移動，并根據(jù)校準(zhǔn)點(diǎn)狀樣本的z位置來檢測在探測器上產(chǎn)生的校準(zhǔn)圖像的形成校準(zhǔn)點(diǎn)狀樣本的光斑的特征參數(shù)。作為所述特征參數(shù)，例如考慮采用探測器上的光斑的形狀和/或延展距離。

為了實施本實用新型的方法，根據(jù)權(quán)利要求14，規(guī)定了一種用于定位試樣中的點(diǎn)狀樣本的光學(xué)顯微機(jī)構(gòu)。

附圖說明

下面參照附圖詳述本實用新型。其中：

圖1為示意圖，其示出用于在z方向上定位點(diǎn)狀樣本的一個實施方式；

圖2為示意圖，其示出用于在z方向上定位點(diǎn)狀樣本的一個替代的實施方式；

圖3示出一種指配規(guī)則，按照該規(guī)則，參照點(diǎn)狀樣本相對于清晰平面的z位置來放置在探測面上檢測到的光斑的形狀；

圖4為示意圖，在該圖中示出了根據(jù)本實用新型所使用的清晰深度區(qū)域；

圖5為示意圖，其示出在z方向上因錯誤的指配信息引起的試樣圖像失真；

圖6為示意圖，其示出如何通過清晰深度區(qū)域的根據(jù)本實用新型發(fā)生的移位來矯正點(diǎn)狀樣本的z位置；和

圖7為曲線圖，其示范性地示出采用根據(jù)圖6的方法產(chǎn)生的矯正函數(shù)。

具體實施方式

首先參照圖1-3介紹兩個實施方式，在這些實施方式中以不同的方式求取特征參數(shù)，所述特征參數(shù)允許在z方向上定位點(diǎn)狀樣本。

圖1示出一種光學(xué)顯微機(jī)構(gòu)10，其帶有作為圖像鏡頭的物鏡12和探測面14。根據(jù)圖1的裝置具有兩個分開的探測通道，在這些探測通道中，圖1中左邊的那個通道主要由物鏡12和第一筒狀透鏡16構(gòu)成，而圖1中右邊的那個通道則由物鏡12和第二筒狀透鏡18構(gòu)成。來自點(diǎn)狀樣本20的光以相同的部分被射線分配器22以及換向鏡24、26和28引到兩個探測通道中。

兩個探測通道在其聚焦位置方面略有不同。這意味著，第一探測通道具有在光學(xué)方面變成(konjugieren)第一清晰平面32的第一圖像面30，而另一探測通道具有在平行于物鏡12的光軸O的方向上即在z方向上相對于第一圖像面30錯開的第二圖像面34，該第二圖像面在光學(xué)方面變成也在z方向上相對于第一清晰平面32錯開的第二清晰平面36。

如果要定位的點(diǎn)狀樣本20位于一個探測通道的清晰面上，它就被物鏡12在那里清晰地成像，而它在另一探測通道中被不清晰地成像。如果它位于兩個清晰平面32和36之間，它就會在兩個探測通道中被不清晰地成像。

前述情況在圖1中通過光斑38、40、42和44來表示，這些光斑根據(jù)點(diǎn)狀樣本20相對于清晰平面32和36的z位置在探測面14上產(chǎn)生。光斑38、40、42和44在圖1中因而在x-y平面的俯視圖中示出。光斑38、40、42和44分別用PSF來表征，PSF由通過物鏡12產(chǎn)生的在探測面14上的聚焦光分布而得到。

如果點(diǎn)狀樣本20位于第一清晰平面32上，就在探測面14上在左邊的探測通道中得到比較小的光斑38，而在右邊的探測通道中得到相比之下較大的光斑42。而若點(diǎn)狀樣本20布置在清晰平面36中，就在探測面14上在左邊的探測通道中得到較大的光斑40，而在右邊的探測通道中得到較小的光斑44。

于是可以由在探測面14上產(chǎn)生的光斑38、40、42和44導(dǎo)出一個特征參數(shù)，該特征參數(shù)是點(diǎn)狀樣本20相對于清晰平面32和36的z位置的量度。作為該特征參數(shù)，例如可以使得在左邊的探測通道中產(chǎn)生的光斑38或44的延展距離與在右邊的探測通道中產(chǎn)生的光斑42或44的延展距離按比例相比。

圖2示出了一種實施方式，在該實施方式中采用其它方式檢測前述特征參數(shù)，該特征參數(shù)能實現(xiàn)求取點(diǎn)狀樣本的z位置。在此，圖2首先在部分圖a)中示出了通常的設(shè)置情況，按照這種設(shè)置，點(diǎn)狀樣本20利用由物鏡透鏡50和筒狀透鏡52構(gòu)成的成像鏡頭54被成像到探測面56上。在這里，點(diǎn)狀樣本20將位于清晰平面58上，該清晰平面就是在光學(xué)方面 變成探測面56的面。

成像鏡頭54使得來自點(diǎn)狀樣本20的光形成為投射到探測面56上的三維的聚焦光分布。探測面56因而檢測到一個光斑60，這個光斑是所述聚焦光分布的垂直于z方向的平面的剖切面。為了更清楚地示出這種情況，在圖2中以探測面56的俯視圖即在x-y平面上示出了該光斑60。

在圖2的部分圖a)中所示的情況下，點(diǎn)狀樣本20位于清晰平面58上，探測面56上的光斑60具有圓形的形狀，即一種關(guān)于在x-z平面和y-z平面上的鏡面對稱的形狀。

圖2在部分圖b)中示出了根據(jù)本實用新型的一種變型設(shè)計，按照這種設(shè)計，除了物鏡50和筒狀透鏡52外，還設(shè)置了柱狀透鏡62。柱狀透鏡62具有在x方向和y方向上不同的折射力，因而對于x方向和y方向來說具有不同的聚焦位置。相應(yīng)地，探測面56上的光斑60在x方向和y方向上呈十字形地變形。點(diǎn)狀樣本20在部分圖b)中恰好位于現(xiàn)在不同的兩個清晰平面的中間，其中，該中間位置也標(biāo)有58。但十字形的光斑60卻保持在前述意義下的對稱。

據(jù)圖2在部分圖c)中所示的情況，點(diǎn)狀樣本20布置在清晰平面58的上方。從清晰平面58錯開導(dǎo)致了探測面56上的光斑60非對稱地變形為一個橢圓。在此，點(diǎn)狀樣本20離開清晰平面58越遠(yuǎn)，光斑60的橢圓形狀就越明顯。

在圖2于部分圖d)中所示的情況下，點(diǎn)狀樣本20位于清晰平面58的下方。在這里，探測面56上的光斑60也橢圓形地變形，然而是在與部分圖c)中的光斑60的方向不同的方向上變形。因此，借助光斑60的形狀可以辨別出點(diǎn)狀樣本20布置在清晰平面40的上方還是下方。如由根據(jù)圖2的視圖可見，可以借助探測面56上的光斑60的形狀和延展距離來確定點(diǎn)狀樣本20相對于清晰平面58的z位置。這在當(dāng)前設(shè)計中借助例如在圖3中示出的指配規(guī)則來實現(xiàn)。這種指配規(guī)則可以通過校準(zhǔn)測量來得到，在這些校準(zhǔn)測量中，有個校準(zhǔn)-點(diǎn)狀樣本沿著z方向從清晰平面58的一側(cè)移至其另一側(cè)，并在這種情況下針對現(xiàn)在已知的z位置來確定光斑的形狀。這樣就得到了指配規(guī)則，其能實現(xiàn)在以后測量時給測得的光斑指配正確的z位置。在實踐中，為此使用一種專用的校準(zhǔn)試樣，例如一種帶有發(fā)熒光的小球或者帶有被照明的且散射性的納米微粒作為校準(zhǔn)點(diǎn)狀樣本。

圖3示出了一種按照上述設(shè)計建立起來的指配規(guī)則。這里把光斑在x方向上的標(biāo)有s_x的延展距離與光斑PSF在y方向上的標(biāo)有s_y的延展距離的差規(guī)定為特征參數(shù)d。這樣就得到了一種指配規(guī)則d(z)，該規(guī)則能實現(xiàn)在真正的圖像攝取時針對測得的每個光斑都確定一個z位置。這個位置然后與x-y位置一起存儲起來，且供產(chǎn)生高分辨率的三維圖像使用。

對可以用來檢測點(diǎn)狀樣本的z位置的指配規(guī)則的確定并不局限于上述實施方式。因而例如開篇所述的雙螺旋法也適合于產(chǎn)生這種指配規(guī)則。

還要指出，圖3中所示功能形式的指配規(guī)則僅僅是一種示范性的設(shè)計。因而例如也可以采用在測得的PSF與事先存儲的或計算的PSF之間的關(guān)系的形式來進(jìn)行圖像比較。與測得的PSF具有最大的相似性的所存儲的或計算的PSF的z位置于是被視為正確的z位置。如果測得的PSF在其形狀方面并不與所存儲的或計算的PSF之一一致，則可以例如通過插值法給它指配一個z位置，這個位置位于所存儲的或計算的PSF的與測得的PSF最相似的z位置之間。

下面參照圖4-7示范性地介紹如何能夠根據(jù)本實用新型基于前述類型的指配規(guī)則來矯正對點(diǎn)狀樣本的定位。

圖4以純示意性的視圖示出根據(jù)本實用新型的顯微機(jī)構(gòu)的一個實施例，其中，在圖4中僅僅示出了用來介紹本實用新型的矯正方法的那些組件。在圖4中尤其省去了探測器。

在根據(jù)圖4的設(shè)置中，物鏡70通過浸漬介質(zhì)78將安置在蓋片玻璃72上的試樣76成像到探測器上。物鏡70具有一個清晰深度區(qū)域78，該區(qū)域沿著物鏡70的光軸O即在z方向上具有軸向的延展距離t。清晰深度區(qū)域78是這樣確定的：位于清晰深度區(qū)域78內(nèi)部的點(diǎn)狀樣本被物鏡70以光斑的形式成像到探測器上，其清晰度足以例如在考慮圖3中所示類型的指配規(guī)則情況下能實現(xiàn)在z方向上進(jìn)行定位。清晰深度區(qū)域78在樣本空間內(nèi)的位置和延展距離因而被預(yù)先確定且是已知的。

根據(jù)圖4的機(jī)構(gòu)還包括控制單元80，該控制單元對機(jī)構(gòu)的全部運(yùn)行加以控制?？刂茊卧?0尤其具有計算元件，該計算元件進(jìn)行對于定位點(diǎn)狀樣本所需要的計算和分析?？刂茊卧?0還控制著壓電執(zhí)行器82，利用該壓電執(zhí)行器可以使得物鏡70沿著光軸O移動，以便使得清晰深度區(qū)域78按規(guī)定的方式沿著光軸O移動。物鏡70進(jìn)而清晰深度區(qū)域78在樣本空間內(nèi)移動一段移調(diào)路程，與控制單元80耦接的傳感器84檢測這段移調(diào)路程。

試樣76含有各種不同的結(jié)構(gòu)90、92、94、96和98，這些結(jié)構(gòu)在清晰深度區(qū)域78中布置在不同的z位置上。這些結(jié)構(gòu)90、92、94、96和98帶有標(biāo)記，所述標(biāo)記形成了要定位的點(diǎn)狀樣本。在攝像期間，位于結(jié)構(gòu)90、92、94、96和98中的那些標(biāo)記分別單獨(dú)地作為光斑成像到探測器上，這些光斑在其位置和形狀方面被控制單元80分析。通過這種方式將產(chǎn)生在z方向上高分辨率的圖像。

在圖5的視圖中示出了錯誤的指配規(guī)則是如何導(dǎo)致圖像在z方向上失真的。因而在圖5的左邊部分中示出了帶有清晰深度區(qū)域78的樣本空間，在該樣本空間中布置著所述結(jié)構(gòu)90、92、94、96和98，而在圖5的右邊部分中示出了這些結(jié)構(gòu)在該圖像空間內(nèi)的成像。在圖像空間內(nèi)的與樣本空間的z位置相應(yīng)的z位置標(biāo)有符合“′”。

在根據(jù)圖5的例子中，錯誤的指配規(guī)則導(dǎo)致了圖像在z′方向上壓縮。

在圖6中示出因錯誤的指配規(guī)則引起的這種圖像壓縮是如何被逐漸消除的，其方式為， 使得清晰深度區(qū)域78分多個步驟在z方向上移動。在此，圖6的部分圖a)相應(yīng)于圖5中所示的情況。

首先在清晰深度區(qū)域78中規(guī)定一個z參考位置，這個參考位置相對于清晰深度區(qū)域78是位置固定的，也就是說，與清晰深度區(qū)域78一起在樣本空間內(nèi)移動。在當(dāng)前例子中，清晰深度區(qū)域78的標(biāo)有z_s的下面的邊界被確定為z參考位置。由于該z參考位置是已知的，所以可以準(zhǔn)確無誤地檢測位于z參考位置的結(jié)構(gòu)在試樣內(nèi)的z位置。這種情況在圖6的部分圖a)中適用于結(jié)構(gòu)90，在該部分圖中，清晰深度區(qū)域78尚未移動。

如果現(xiàn)在將試樣成像到探測器上，并隨后使得清晰深度區(qū)域78連同其z參考位置移動至位置z_s＝z₁，就會得到在圖6的部分圖b)中示出的情況。在那里，結(jié)構(gòu)92位于清晰深度區(qū)域78的z參考位置。對于布置在z參考位置的結(jié)構(gòu)92所含有的那些點(diǎn)狀樣本來說，現(xiàn)在可以準(zhǔn)確地確定z位置。由布置在z參考位置的點(diǎn)狀樣本在探測器上產(chǎn)生的光斑在下面稱為參考光斑?，F(xiàn)在，借助這些參考光斑，在先前攝取的第一試樣圖像(圖6的部分圖a)中確定出與在清晰深度區(qū)域78移動后攝取的第二試樣圖像的參考光斑相應(yīng)的光斑。在第一試樣圖像中含有的這些光斑在下面稱為比較光斑。

如對圖6的部分圖a)和b)的比較所示，在第一試樣圖像內(nèi)，由于指配規(guī)則錯誤，在結(jié)構(gòu)92中含有的點(diǎn)狀樣本的z位置是錯誤的，即已用一個太小的值z_x′求取。這個錯誤的值現(xiàn)在可以用在第二試樣圖像內(nèi)被正確地求取的值來代替，并因而予以矯正。該正確的值已知為z₁＝z₁′。

如圖7中所示，現(xiàn)在可以在曲線上參照錯誤的位置z_x′，即針對結(jié)構(gòu)92在第一試樣圖像、部分圖a)中已找到的位置，繪出結(jié)構(gòu)92的正確的位置z₁。

現(xiàn)在使得清晰深度區(qū)域78又移動一段規(guī)定的移調(diào)路程，這段移調(diào)路程小于清晰深度區(qū)域78的軸向的延展距離t。相同長度的各個軸向移調(diào)路程的總和基本上等于清晰深度區(qū)域(78)的軸向延展距離。在這個例子中，在第二移動步驟中規(guī)定的移調(diào)路程又等于量值D_z，從而z參考位置移動至位置z₂。同樣攝取試樣圖像，也要考察布置在z參考位置即布置在清晰深度區(qū)域78的下邊界處的結(jié)構(gòu)。根據(jù)圖6的部分圖c)，這在當(dāng)前就是結(jié)構(gòu)94，該結(jié)構(gòu)的在探測器上的點(diǎn)狀樣本產(chǎn)生了相關(guān)的參考斑點(diǎn)。借助于這些參考斑點(diǎn)又在第一試樣圖像(圖6的部分圖a)中確定出相關(guān)的比較光斑，也就是說，在第一試樣圖像中搜尋結(jié)構(gòu)94。在第一試樣圖像中給結(jié)構(gòu)94指配z位置z₊′。在根據(jù)圖7的曲線上，參照該位置z₊′繪出正確的位置z₂。

采用前述方式以適當(dāng)數(shù)量的步驟進(jìn)行操作，如圖6中部分圖d)和e)所示，直到覆蓋在圖6的部分圖a)中示出的整個最初的清晰深度區(qū)域。

對于在第一試樣圖像中已再次找到的全部結(jié)構(gòu)來說，現(xiàn)在可以借助根據(jù)圖7的曲線在 縱坐標(biāo)上讀出正確的位置。基于所示的測量點(diǎn)，可以借助于合適的對通常的校準(zhǔn)錯誤予以考慮的模型函數(shù)來得到矯正規(guī)則。也可以有選擇地采用簡單的樣條插值法或其它類型的插值法，以便得到矯正規(guī)則。圖7中標(biāo)有c(z′)的該矯正規(guī)則現(xiàn)在可以用來矯正第一試樣圖像(圖6的部分圖a)。由此針對在第一試樣圖像中求取的全部位置z′根據(jù)矯正規(guī)則c(z′)得到各自正確的z位置。

需要指出，前述方法純粹是示范性的。不言而喻，也可以采用不同于所述的其它算法。尤其在實踐應(yīng)用中可以并非僅僅確定在清晰深度區(qū)域內(nèi)的一個唯一的位置固定的z參考位置，比如在圖4-7中所示的例子就是這種情況。因而可以在清晰深度區(qū)域的其它位置規(guī)定其它z參考位置。

也可以考慮的是，不僅考察第n個圖像相對于第一個試樣圖像的偏差，而且獲取第n個圖像的結(jié)構(gòu)相對于第m個圖像的結(jié)構(gòu)的位置偏差，其中，n和m是等于或大于1的自然數(shù)。這樣就得到了更多的測量點(diǎn)，從而可以得到更精確的矯正規(guī)則。也可以采用直接確定與在第m個圖像中同樣出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)相比而言第n個圖像的失真的圖像處理算法。重要的僅僅是，通過清晰深度區(qū)域的非常準(zhǔn)確的移動，得到關(guān)于所考察的結(jié)構(gòu)的z位置的附加信息，該信息用于定位點(diǎn)狀樣本。

也可以在樣本空間和圖像空間內(nèi)部靈活地調(diào)整z或z′的值范圍，即調(diào)整清晰深度區(qū)域和相應(yīng)的圖像區(qū)域，如果矯正規(guī)則不能應(yīng)用于相應(yīng)的整個試樣區(qū)域。

此外也可行的是，利用移動的清晰深度區(qū)域已得到的位置信息不僅用于矯正在第一試樣圖像中得到的z位置，而且可以在圖像產(chǎn)生本身中考慮該位置信息。