本發(fā)明涉及選擇性平面照明顯微鏡學(xué)（spim）以及具體地，但不專門地涉及對可適配于采用包含spim的多于一個(gè)顯微鏡學(xué)技術(shù)的顯微鏡學(xué)儀器。

背景技術(shù)：

spim是熒光顯微鏡學(xué)成像技術(shù)，與更傳統(tǒng)的顯微鏡學(xué)技術(shù)相比,該spim實(shí)現(xiàn)因光毒性和光褪色中顯著的降低而引起的有效動(dòng)態(tài)樣本（livedynamicsample）的擴(kuò)展成像。spim采用例如由柱面透鏡生成的激勵(lì)照明的線或平面（通常稱為光片（lightsheet）），以及采用垂直檢測幾何結(jié)構(gòu)以允許樣本的光學(xué)分段檢驗(yàn)。另外，spim照明生成焦點(diǎn)背景信號(hào)的降低輸出，其極大增強(qiáng)三維試樣（specimen）的圖像質(zhì)量。在us7554725中示出spim的示例。

在spim的大多數(shù)實(shí)現(xiàn)中，spim系統(tǒng)圍繞試樣來設(shè)計(jì)，從而要求新穎的樣本制備，例如將樣本嵌入在瓊脂糖膠中，這排除使用例如玻璃蓋片的傳統(tǒng)樣本支架（samplemount），其與很多傳統(tǒng)顯微鏡一起使用。雖然顯微鏡學(xué)的其它類型，例如傾斜平面顯微鏡學(xué)（opm），使用相同的物鏡來照亮以及檢測試樣并且能夠適應(yīng)上述新穎的樣本制備，但這樣的顯微鏡學(xué)系統(tǒng)遭受相對于其它方法學(xué)低的數(shù)值孔徑，以及因此要求大量的光學(xué)器件來校正由相對于顯微鏡的檢測平面所傾斜的光片引起的像差。因此，能夠容易地將現(xiàn)有傳統(tǒng)顯微鏡轉(zhuǎn)換成適應(yīng)spim將會(huì)是期望的。在wo2012122027中示出這樣的轉(zhuǎn)換.

利用spim的先前的儀器的不利特征（包含在wo2012122027中示出的轉(zhuǎn)換）是物鏡的非傳統(tǒng)定位，其導(dǎo)致兩個(gè)關(guān)鍵劣勢。第一，樣本制備、樣本裝載和樣本卸載是繁重的和有挑戰(zhàn)性的。先前的嘗試對于適配傳統(tǒng)儀器以便維護(hù)其它強(qiáng)大的顯微鏡學(xué)成像模式（包含但不限于sim（結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡學(xué)）和tirf（全內(nèi)角反射熒光顯微鏡學(xué)））的成像功能性未能經(jīng)得起檢驗(yàn)。這樣做的一個(gè)方式是要重新布置照明和成像物鏡的光軸線。在us8472113中示出這樣的重新布置的一個(gè)嘗試。然而，在us8472113和wo2012122027中示出的布置使用來自上述的照明，這妨礙樣本裝載和卸載，因?yàn)椴倏乜臻g因此是非常受限的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了光學(xué)布置，其提供選擇性平面照明，光學(xué)布置包含安裝在樣本支承下的在樣本支承處提供光線或平面的使用中的反向照明物鏡，以及安裝在支承上的至少一個(gè)圖像收集物鏡，所述反向照明物鏡具有照明物鏡光學(xué)軸線，以及所述圖像收集物鏡具有圖像收集物鏡光學(xué)軸線，其中，照明光布置成向照明物鏡橫向偏移于照明物鏡光學(xué)軸線地傳播，使得離開照明物鏡的照明光以相對于照明物鏡光學(xué)軸線的傾斜角度而向樣本支承傳播，以及其中圖像物鏡光學(xué)軸線具有角度α，其對于照明物鏡光學(xué)軸線是鈍角的以及通常垂直于在樣本支承處傳播的光。

因此，光學(xué)布置是這樣的以至于照明來自下面，這允許其它高分辨率顯微鏡學(xué)儀器的方便適配。本文所述實(shí)施例的關(guān)鍵進(jìn)步是對使用定位在反向配置（其可易于適配于附加熒光顯微鏡學(xué)成像模式）中的傳統(tǒng)油或水浸液物鏡的spim的提供。而且，為了方便的樣本制備或者更簡單的準(zhǔn)備樣本裝載/卸載，成像光學(xué)器件能夠不恰當(dāng)?shù)靥岣摺?/p>

在改進(jìn)中，能夠采用一對成像物鏡，在照明物鏡光學(xué)軸線每側(cè)上各一個(gè)，以提供整個(gè)三維樣本體積的等向性高分辨率成像。

根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供spim顯微鏡學(xué)儀器，其包含具有照明物鏡光學(xué)軸線的照明物鏡以及包含在垂直于照明物鏡光學(xué)軸線的方向上相對于所述軸線可移動(dòng)的以及優(yōu)選地在連續(xù)動(dòng)作中如此可移動(dòng)的樣本支承。

本發(fā)明提供根據(jù)權(quán)利要求1的光學(xué)布置，其具有由從屬于權(quán)利要求1的權(quán)利要求所限定的優(yōu)選特征。本發(fā)明還提供如由權(quán)利要求5限定的照亮樣本的方法，以及根據(jù)權(quán)利要求6到9的顯微鏡學(xué)儀器。本發(fā)明還提供根據(jù)權(quán)利要求10的spim儀器。

本發(fā)明擴(kuò)展至本文所公開的特征的任何組合，無論這樣的組合是否明確在本文中提及。此外，在兩個(gè)或多個(gè)特征在組合中提及的情況下，意圖在沒有擴(kuò)展本發(fā)明范圍的情況下，這樣的特征可單獨(dú)地被要求。

附圖說明

本發(fā)明能夠以多個(gè)方式實(shí)行，其示意性實(shí)施例在下文參考附圖來描述，其中：

圖1a示出spim的光學(xué)布置的示意性表示；

圖1b示出采用圖1a光學(xué)布置的顯微鏡學(xué)儀器；

圖2示出圖1a中所示的光學(xué)布置的第一光束路徑模型；

圖3示出圖1a中所示的光學(xué)布置的第二光束路徑模型；以及

圖4示出采用移動(dòng)樣本支承的示意性表示。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明與它的目的和它的優(yōu)勢一起參考與附圖結(jié)合所進(jìn)行的下面的描述可被更好地理解，其中相似的參考數(shù)字在圖中識(shí)別相似的元件。

參考圖1a，光學(xué)布置100以橫截面示意性地示出，以及spim儀器10示出在合并圖1a的光學(xué)布置的圖1b中。圖示spim儀器物鏡透鏡110，其提供光線或平面/片（本文被稱為線），線在垂直于紙以及進(jìn)入紙中的方向上延伸。照明物鏡透鏡110在反向配置中定位在樣本支承120下，以便與高分辨率與超分辨率的熒光顯微鏡的典型配置相兼容。照明物鏡透鏡110具有照明物鏡光學(xué)軸線111。兩個(gè)單獨(dú)的圖像收集物鏡透鏡130和140定位在樣本支承120上，每個(gè)分別具有圖像收集物鏡光學(xué)軸線131和141。在照明物鏡光學(xué)軸線和圖像收集物鏡光學(xué)軸線131和141之間的角度α是大約135度。因此，圖像收集物鏡的光學(xué)軸線131和141相對于反向照明物鏡透鏡的光學(xué)軸線111處于+135度和-135度。

在使用中，采取光線的形式的相干激光光束132和142交替地指向照明物鏡透鏡110。每個(gè)束是平行的但橫向偏移光學(xué)軸線111距離x，使得每個(gè)束在物鏡透鏡110處折射以在樣本支承120的樣本保持區(qū)域122處相對于光學(xué)軸線111傾斜地傳播。

樣本s能夠在樣本區(qū)域122處通過束132和142的傾斜相（obliquephase）來照亮。照明線用來通過樣本選擇性地照亮部分（section），以及漫射圖像光（diffuseimagelight）通過通常垂直于束132和142的光線的傳播方向上安裝的相應(yīng)的圖像收集物鏡130和140來收集，使得光線通常停留在圖像收集物鏡的焦平面處。

雙圖像收集物鏡130和140的目的是要提供整個(gè)三維樣本體積的各向同性的高分辨率成像。結(jié)構(gòu)化圖像能夠從來自左和右照明的一系列圖像來制定。

上文所述的光學(xué)布置提供照明的細(xì)線，其向上通過反向物鏡透鏡110，但以相對于透鏡的光學(xué)軸線111稍微橫向偏移x來傳播，使得離開透鏡的束精準(zhǔn)地轉(zhuǎn)向?yàn)閳D像搜集物鏡130或140的焦平面的角度。即，正交于圖像收集物鏡的光學(xué)軸線131和141。以這種方式，只有相對于成像透鏡焦點(diǎn)對準(zhǔn)的樣本的薄部分由照明束132或142來激勵(lì)。為了對兩個(gè)圖像收集物鏡透鏡130和140提供照明，照明束的上述橫向偏移x將交替在兩個(gè)離散橫向偏移位置之間，其位于反向照明物鏡透鏡110的光學(xué)軸線111的同等和相對側(cè)上。在兩個(gè)離散橫向偏移位置之間的束切換能夠通過例如光電子-機(jī)械切換機(jī)制（包含但不限于檢流計(jì)反射鏡、壓電反射鏡或者鰭狀反射鏡）的各種光操縱器來實(shí)現(xiàn)。同樣地，跨樣本平面的整個(gè)視野的束掃描能夠通過各種光電子-機(jī)械的掃描機(jī)制（包含但不限于檢流計(jì)反射鏡、壓電反射鏡或者旋轉(zhuǎn)多面體反射鏡）來實(shí)現(xiàn)。在照明模式（spim、sim、tirf、pk等）之間的切換能夠通過利用以對每個(gè)支持的模式關(guān)聯(lián)的束迂回路徑的從檢流計(jì)反射鏡的多個(gè)反射來實(shí)現(xiàn)，例如如先前在wo2013074033a1中所述，其內(nèi)容通過引用合并在本文中。

圖2和圖3示出兩個(gè)照明束路徑132和142的束路徑模型，以及具體地圖示圖像收集物鏡收集從通常垂直于照明路徑的樣本區(qū)域122傳播的光。

圖4更詳細(xì)示出光學(xué)布置，以及更清楚地圖示本發(fā)明的第二方面。在該實(shí)施例中，樣本支承120在由3個(gè)物鏡透鏡110、130和140的光學(xué)軸線限定的x平面中是可移動(dòng)的。該移動(dòng)在無需對跨多個(gè)相鄰圖像平面掃描照明束的要求的情況下提供通過三維樣本體積分段的方法。本技術(shù)涉及樣本支承120的移動(dòng)，其優(yōu)選地通過線性滑道或者兩個(gè)正交相對滑道和電馬達(dá)傳動(dòng)或多個(gè)傳動(dòng)。通過移動(dòng)樣本來水平地進(jìn)行掃描。理想地，掃描將會(huì)是連續(xù)的而不是以不連續(xù)的階段，以便使樣本介質(zhì)（其對于離散橫向擾動(dòng)將會(huì)是敏感的）的振動(dòng)最小化。該方法具有三個(gè)截然不同的優(yōu)勢。第一，它減少對照明束的掃描控制機(jī)制的數(shù)量。第二，它消除在掃描時(shí)提供圖像收集物鏡的光電子-機(jī)械深度控制的需要。這前兩個(gè)優(yōu)勢極大簡化光電子-機(jī)械系統(tǒng)設(shè)計(jì)，同時(shí)還提高系統(tǒng)穩(wěn)定性和可對準(zhǔn)性。第三個(gè)優(yōu)勢是功能的優(yōu)勢，其中樣本的所提議的水平掃描允許沿一個(gè)橫向軸線的無限制視野以適應(yīng)加長型的試樣，例如秀麗隱桿線蟲。為了使該spim光學(xué)布置與其它已知的高分辨率顯微鏡學(xué)技術(shù)相兼容，在樣本支承120和照明物鏡110之間的空間由液體（在該情況中是浸油124）橋接。

雖然兩個(gè)實(shí)施例已經(jīng)被描述和圖示，對本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的是，在沒有偏離所要求的本發(fā)明范圍的情況下，對那些實(shí)施例的增加、省略和修改是可能的。例如，在光學(xué)軸線111和131之間或者在軸線111和141之間的角度α在原則上能夠處于在大約100度和大約170度之間的范圍中任何位置，然而，135度支持最大的聚光容量并且因此被認(rèn)為是最佳的，以及125至145度是滿意的。