本發(fā)明涉及光學(xué)顯微鏡成像的，尤其是指一種大深度雙光子三維超分辨成像系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)：

1、光學(xué)顯微鏡具有非侵入性和高分辨率等特點，非常適合于活體生物成像。然而，生物體中許多重要的結(jié)構(gòu)和功能信息都位于深層組織內(nèi)部。此外，光在傳播過程中存在衍射現(xiàn)象，尤其在生物組織內(nèi)部傳播過程中會發(fā)生強(qiáng)烈的散射，導(dǎo)致激發(fā)和發(fā)射光信號隨著成像深度的增加迅速衰減，極大地阻礙人類對生物體內(nèi)部世界的探索。因此，對深層生物組織進(jìn)行高質(zhì)量成像并獲取有效的結(jié)構(gòu)和功能信息，是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究的熱點和難點。

2、雙光子顯微成像技術(shù)(two-photon?microscopy,tpm)采用非線性光學(xué)效應(yīng)，即一個基態(tài)熒光分子同時吸收兩個光子后躍遷到激發(fā)態(tài)，然后返回基態(tài)并釋放出熒光信號。雙光子顯微成像采用長波長激發(fā)，具有高信噪比和大穿透深度(幾百微米)的優(yōu)勢，已成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)支撐。然而，長波長的使用和組織中強(qiáng)散射的存在使得成像分辨率顯著下降。此外，傳統(tǒng)tpm仍然受到光學(xué)衍射極限的限制。為了突破光學(xué)衍射極限，超分辨成像技術(shù)應(yīng)運而生。近年來，雙光子成像技術(shù)結(jié)合基于不同原理的超分辨成像方法，包括受激輻射損耗(stimu?lated?emission?depl?etion,sted)顯微鏡、結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(structured?i?l?l?umination?microscopy,sim)和單分子定位顯微鏡(si?ngle-mo?lecule?l?oca?l?ization?microscopy,smlm)等，可以將雙光子成像的分辨率從幾百納米提高到幾十納米，使其可以分辨更精細(xì)的生物組織與結(jié)構(gòu)。但是，上述技術(shù)都是基于熒光“開/關(guān)”態(tài)的超分辨成像原理，不僅需要具有特殊光物理化學(xué)特性的熒光探針，而且在追求超分辨率極限時會產(chǎn)生一系列新的問題，比如高的激光功率、低的成像速度、復(fù)雜的成像系統(tǒng)和昂貴的實驗成本等。此外，這些技術(shù)尚未能實現(xiàn)大于100微米深度的超分辨成像。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種大深度雙光子三維超分辨成像系統(tǒng)，旨在提高成像分辨率。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種大深度雙光子三維超分辨成像系統(tǒng)，包括：飛秒脈沖激光器、第一分束鏡、空間光調(diào)制器、角反射器、第二分束鏡、雙色鏡、光電倍增管、時間相關(guān)單光子計數(shù)器、成像處理終端、振鏡、顯微鏡及三維移動載物平臺；

3、所述第一分束鏡設(shè)在飛秒脈沖激光器的出光光路上，用于將飛秒脈沖激光器發(fā)出的高斯光束一分為二，形成透射光路及反射光路；所述空間光調(diào)制器設(shè)在透射光路上，用于將透射激光束進(jìn)行兩次非相干調(diào)制后轉(zhuǎn)換成中心強(qiáng)度為零的三維籠式光束；所述角反射器設(shè)在反射光路上，用于調(diào)節(jié)高斯光束與三維籠式光束之間的脈沖間隔，脈沖間隔調(diào)節(jié)至所用熒光染料熒光壽命的50％-100％；所述第二分束鏡用于將三維籠式光束與角反射器出來的高斯光束進(jìn)行合束；

4、所述雙色鏡、振鏡、顯微鏡及三維移動載物平臺依次設(shè)在第二分束鏡的合束光束的出光光路上，所述雙色鏡與合束光束呈45°夾角；合束得到的合束光束依次經(jīng)過振鏡、顯微鏡到達(dá)三維移動載物平臺，對放置在三維移動載物平臺的樣品進(jìn)行照射；樣品產(chǎn)生的雙光子熒光原路返回到雙色鏡，雙色鏡將雙光子熒光反射到光電倍增管進(jìn)行光電信號轉(zhuǎn)換及電信號放大；

5、所述光電倍增管、時間相關(guān)單光子計數(shù)器、成像處理終端依次電信號連接，所述時間相關(guān)單光子計數(shù)器用于同時接收飛秒脈沖激光器輸入的脈沖同步信號及光電倍增管采集熒光放大后的雙光子熒光信號，并測量和記錄雙光子熒光信號的時空信息；成像處理終端用于對光子熒光信號的時空信息進(jìn)行處理，形成樣品圖像。

6、進(jìn)一步的，所述第一分束鏡后設(shè)有二分之一玻片及第一反射鏡，所述二分之一玻片用于對將透射激光束進(jìn)行偏振調(diào)節(jié)；所述第一反射鏡用于將調(diào)節(jié)后的透射激光束以45°偏振方向入射到空間光調(diào)制器上。

7、進(jìn)一步的，所述透射光路上還設(shè)有四分之一玻片、第一透鏡及第二反射鏡；所述空間光調(diào)制器的液晶面分成左右相等的兩個區(qū)域，在空間光調(diào)制器的液晶面左側(cè)區(qū)域加載渦旋相位，對入射光束的偏振p分量進(jìn)行調(diào)制，反射光依次經(jīng)過第一透鏡和四分之一玻片，被第二反射鏡反射后再經(jīng)過第一透鏡和四分之一玻片到達(dá)空間光調(diào)制器的液晶面右側(cè)區(qū)域，空間光調(diào)制器的液晶面右側(cè)區(qū)域加載0/π相位，對入射光束的另一個垂直分量進(jìn)行調(diào)制，四分之一玻片將光束的偏振矢量旋轉(zhuǎn)90°，允許通過空間光調(diào)制器的右側(cè)調(diào)制入射光的垂直分量，即s分量；第二反射鏡和光調(diào)制器分別設(shè)在第一透鏡的前后焦點處，以保持激光波前的共軛調(diào)制。

8、進(jìn)一步的，透射光路上還設(shè)有第三反射鏡及第四反射鏡，所述第三反射鏡將空間光調(diào)制器的液晶面右側(cè)區(qū)域出來的出射光束反射到第四反射鏡；所述第四反射鏡將第三反射鏡反射過來的出射光束反射到第二分束鏡。

9、進(jìn)一步的，所述反射光路上設(shè)有第五反射鏡及第六反射鏡，所述第五反射鏡將第一分束鏡的反射光反射到角反射器上，所述第六反射鏡將角反射器上出來的高斯光束反射到第二分束鏡上。

10、進(jìn)一步的，所述雙色鏡到光電倍增管之間還設(shè)有第二透鏡及濾光片。

11、進(jìn)一步的，所述顯微鏡依次包括掃描透鏡、管鏡及物鏡。

12、本發(fā)明還提供了一種大深度雙光子三維超分辨成像方法，應(yīng)用于上述的大深度雙光子三維超分辨成像系統(tǒng)，包括：

13、將飛秒脈沖激光器發(fā)出的高斯光束通過第一分束鏡一分為二，形成透射光路及反射光路；

14、透射光路的高斯光束通過空間光調(diào)制器進(jìn)行兩次非相干調(diào)制后產(chǎn)生中心強(qiáng)度為零的三維籠式光束；

15、反射光路的高斯光束通過角反射器調(diào)節(jié)高斯光束與三維籠式光束之間的脈沖間隔，脈沖間隔調(diào)節(jié)至所用熒光染料熒光壽命的50％-100％；

16、將空間光調(diào)制器調(diào)制出來的三維籠式光束和角反射器調(diào)節(jié)出來的高斯光束通過第二分束鏡進(jìn)行合束；

17、將合束光束依次經(jīng)過雙色鏡透射、振鏡反射、掃描透鏡透射及顯微鏡透射聚焦后照射到樣品；

18、樣品產(chǎn)生的雙光子熒光原路返回到雙色鏡，雙色鏡將雙光子熒光反射到光電倍增管進(jìn)行光電信號轉(zhuǎn)換及電信號放大；

19、時間相關(guān)單光子計數(shù)器用于同時接收飛秒脈沖激光器輸入的脈沖同步信號及光電倍增管采集熒光放大后的雙光子熒光信號，并測量和記錄雙光子熒光信號的時空信息；

20、成像處理終端對雙光子熒光信號的時空信息進(jìn)行處理，形成樣品圖像。

21、進(jìn)一步的，時間相關(guān)單光子計數(shù)器用于同時接收飛秒脈沖激光器輸入的脈沖同步信號及光電倍增管采集熒光放大后的雙光子熒光信號，并測量和記錄雙光子熒光信號的時空信息具體包括，

22、通過時間相關(guān)單光子計數(shù)器采集兩束激光脈沖后產(chǎn)生的雙光子熒光，得到熒光壽命數(shù)據(jù)；

23、將熒光衰減曲線中強(qiáng)度突變位置所在的時間通道作為界限，提取通道之前的信號組成光籠圖像，提取通道之后的信號組成混合圖像，此時混合圖像中包含部分光籠光束激發(fā)的熒光信號，混合圖像的混合點擴(kuò)展函數(shù)包含高斯點擴(kuò)展函數(shù)和光籠點擴(kuò)展函數(shù)；

24、當(dāng)?shù)玫交旌蠄D像和光籠圖像后，對混合圖像和強(qiáng)度增強(qiáng)的光籠圖像進(jìn)行強(qiáng)度差分，即i超分辨圖像(x,y)＝i混合圖像(x,y)-k×i光籠圖像(x,y)，其中k>1；

25、對樣品進(jìn)行三維成像并采集熒光壽命數(shù)據(jù)，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后得到一系列二維超分辨圖像，將所有二維超分辨圖像進(jìn)行疊加后得到最終的三維超分辨圖像。

26、進(jìn)一步的，大深度雙光子三維超分辨成像方法，還包括：根據(jù)實時成像的樣品圖像調(diào)整掃描透鏡及所述顯微鏡以進(jìn)行光斑調(diào)節(jié)，使所述合束光束的三維籠式光束及高斯光束的焦平面在空間上重合。

27、本發(fā)明的有益效果在于：結(jié)合雙光子成像、信號時空調(diào)制和光場調(diào)控技術(shù)來提升光學(xué)顯微成像深度和三維成像分辨率，通過對激發(fā)光束外圍光子的進(jìn)行強(qiáng)度差分來提取光束中心的高頻信號，在深度500微米內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)于100nm的橫向分辨率和120nm的軸向分辨率。