本發(fā)明屬于可見光顯微，具體涉及一種基于光錐照明的反射式掃描超分辨光學顯微系統(tǒng)及方法。

背景技術：

1、現(xiàn)有顯微技術大致可分為近場顯微與遠場顯微兩大類，近場顯微包括微球體輔助成像、近場掃描顯微等方法。近場顯微方法能實現(xiàn)超分辨顯微成像，但其工作距離小于工作波長，極大的限制了其實際應用；遠場超分辨技術，工作距離大，可以克服近場顯微技術的不足?，F(xiàn)有的遠場超分辨顯微技術包括受激發(fā)射損耗顯微、局部激活顯微、隨機光重構光學顯微等。然而，這些技術都需要對被檢測樣品進行熒光分子標記。非標記的遠場超分辨顯微技術，具有工作距離大、無需對樣品進行標記，使用方便，因此成為超分辨光學顯微鏡的技術的重要發(fā)展趨勢。近年來，基于超衍射器件的非標記遠場超分辨顯微已有少數(shù)實驗報道。這些系統(tǒng)都依賴于新型的超分辨器件作為照明器件；然而，超分辨器件的聚焦效率通常較低，且這些系統(tǒng)大都依賴于移動樣品掃描，成像速度慢。

2、技術背景參考文獻：

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8、如專利文獻cn118465998a公開的一種基于光錐照明的反射式超分辨光學顯微系統(tǒng)及方法。但是該方法通過樣品模塊帶動樣品移動，實現(xiàn)掃描成像，因此成像速度受限于樣品移動的速度，難以實現(xiàn)實時成像。特別是在溶液中的樣品，樣品模塊的快速移動，會導致樣品無法跟隨樣品模塊的移動速度，導致對樣品成像的模糊。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種基于光錐照明的反射式掃描超分辨光學顯微系統(tǒng)及方法，以實現(xiàn)更佳的分辨率，同時提高可靠性、成像速度。

2、第一方面，本發(fā)明所述的基于光錐照明的反射式掃描超分辨光學顯微系統(tǒng)，包括：

3、樣品位移模塊，用于帶動樣品移動；

4、光學顯微成像模塊，用于對樣品進行寬場成像，確定超分辨掃描成像區(qū)域；

5、環(huán)形聚焦光束產生模塊，用于產生環(huán)形聚焦光束，該環(huán)形聚焦光束產生模塊沿著光線傳播方向依次包括光源模塊、第一線偏振片、錐透鏡、第一正透鏡、第二正透鏡和第三正透鏡，其中第一正透鏡與錐透鏡同軸間隔放置，第二正透鏡的前焦平面與第一正透鏡的后焦平面重合，第二正透鏡的后焦平面與第三正透鏡的前焦平面重合，第二正透鏡與第三正透鏡構成第一4f系統(tǒng)；光源模塊產生準直激光束，該準直激光束經過第一線偏振片、錐透鏡和第一正透鏡后形成線偏振環(huán)形聚焦光束，并在第一正透鏡后焦平面形成圓形聚焦線；

6、光束掃描模塊，其包括光束掃描振鏡、光束掃描透鏡、第一套筒鏡和反射鏡，其中光束掃描振鏡的中心位置與第三正透鏡的后焦平面重合；光束掃描透鏡的前焦平面位于光束掃描振鏡的中心位置；光束掃描透鏡的后焦平面與第一套筒鏡的前焦平面重合，兩者構成第二4f系統(tǒng)；第一套筒鏡的后焦平面經過反射鏡反射后與超分辨聚焦照明與收集模塊中物鏡的后焦平面重合；光束掃描振鏡含有控制器，控制器用于與計算機連接，計算機通過光束掃描振鏡的控制器控制光束掃描振鏡進行二維振動掃描；

7、超分辨聚焦照明與收集模塊，用于將環(huán)形聚焦光束轉化為超分辨錐形聚焦光束，形成長焦深超分辨焦斑對樣品進行照明，收集由樣品反射和散射產生的超分辨信號光，分別匯聚和準直反射和散射的超分辨光信號，并完成偏振轉化；該超分辨聚焦照明與收集模塊包括物鏡，樣品位于物鏡的前焦平面上；

8、超分辨光學成像模塊，用于獲取返回的超分辨信號光，并將其轉換為電信號；該超分辨光學成像模塊還包括偏振分束器、空間濾波器、第二線偏振片、第二套筒鏡、光纖頭、光電倍增管和高速采集卡，偏振分束器位于第一正透鏡和第二正透鏡之間，空間濾波器位于光線經過第二正透鏡聚焦和偏振分束器反射后所形成的焦平面上；第二線偏振片位于空間濾波器和第二套筒鏡之間，光纖頭的前端面與第二套筒鏡的后焦平面重合，光纖頭與光電倍增管連接，光電倍增管與高速采集卡連接，高速采集卡用于與計算機連接；

9、計算機，用于控制樣品位移模塊帶動樣品移動，通過同步控制光束掃描振鏡掃描和接收超分辨光學成像模塊輸出的電信號，并處理得到超分辨掃描成像區(qū)域內樣品的超分辨顯微圖像。

10、可選地，當環(huán)形聚焦光束產生模塊產生的環(huán)形聚焦光束，經光束掃描振鏡反射，通過掃描透鏡和第一套筒鏡后，經過反射鏡反射到物鏡的后焦平面；當光束掃描振鏡振動時，環(huán)形聚焦光束中心與物鏡后焦平面中心重合，且環(huán)形聚焦光束的入射角度隨著光束掃描振鏡的振動而改變；當光束掃描振鏡進行二維掃描時，環(huán)形聚焦光束經過物鏡轉換后，形成錐形聚焦光束，進而形成長焦深聚焦光場，將在物鏡的前焦平面上形成超分辨聚焦光斑，該聚焦光斑將隨著光束掃描振鏡的振動，在物鏡的前焦平面上實現(xiàn)連續(xù)的二維掃描；并通過控制物鏡后焦平面在z軸方向的位置，以實現(xiàn)控制在物鏡的前焦平面上連續(xù)的二維掃描的空間范圍。

11、優(yōu)選的，所述超分辨聚焦照明與收集模塊還包括四分之一波片；所述超分辨光學成像模塊還包括偏振分束器；所述光學顯微成像模塊包括第二分束器；從光束掃描模塊出射的圓形聚焦線偏振光束通過四分之一波片后，在物鏡后焦平面上形成外徑小于物鏡的后焦平面直徑的圓偏振圓形聚焦線，所述圓偏振圓形聚焦線通過物鏡后轉化為超分辨錐形聚焦光束，在物鏡的前焦平面上形成超分辨聚焦光斑，該超分辨聚焦光斑對樣品進行照明，由樣品反射和散射產生的超分辨信號光被物鏡收集并分別匯聚和準直后，通過四分之一波片轉化成與入射線偏振正交的線偏振環(huán)形聚焦光束和線偏振準直光束，即線偏振超分辨信號光束，該線偏振超分辨信號光束透射經過第二分束器沿原光路反方向，經過光束掃描模塊，進入環(huán)形聚焦光束產生模塊，并由放置在光路中的偏振分束器反射進入到超分辨光學成像模塊；

12、當光束掃描模塊中光束掃描振鏡作二維掃描時，環(huán)形聚焦光束被物鏡轉化成為錐形聚焦光束，在物鏡的前焦平面形成的超分辨聚焦光斑將隨著光束掃描振鏡的振動，在物鏡的前焦平面上實現(xiàn)連續(xù)的二維掃描；超分辨聚焦光斑在樣品上照明的位置的橫坐標x(t)和縱坐標y(t)為時間t的函數(shù)，物鏡收集的反射光er(t)和散射光es(t)也為時間的函數(shù)，反射光er(t)和散射光es(t)反映了對應位置（橫坐標x(t)和縱坐標y(t)）處樣品結構及折射率等信息。

13、優(yōu)選的，所述超分辨聚焦光斑為環(huán)形聚焦光場，該環(huán)形聚焦光場的內外面為同軸且等錐角的兩個圓錐面，該環(huán)形聚焦光場對應的數(shù)值孔徑nac，且滿足：nac<na，其中，na表示物鏡的數(shù)值孔徑。

14、優(yōu)選的，要實現(xiàn)樣品的三維層析掃描，樣品位移模塊有兩種結構。

15、第一種，樣品位移模塊為二維位移臺，二維位移臺與計算機連接，樣品水平固定在二維位移臺上，計算機控制二維位移臺帶動樣品在xy平面內二維移動，實現(xiàn)樣品的初定位；所述超分辨聚焦照明與收集模塊還包括軸向納米定位器，軸向納米定位器與計算機連接，物鏡安裝在軸向納米定位器上，計算機控制軸向納米定位器帶動物鏡在z向移動。光束掃描模塊實現(xiàn)樣品的二維掃描，結合軸向納米定位器實現(xiàn)三維層析掃描。

16、第二種，樣品位移模塊為三維位移臺，三維位移臺與計算機連接，樣品水平固定在三維位移臺上，計算機控制三維位移臺帶動樣品在x、y、z三個方向上移動，其中x、y兩個方向，實現(xiàn)樣品的初定位；光束掃描模塊實現(xiàn)樣品的二維掃描，結合三維位移臺z方向位移實現(xiàn)三維層析掃描，避免了物鏡微小移動帶來的成像影響，成像效果更好。

17、優(yōu)選的，所述超分辨光學成像模塊還包括五維調節(jié)架，光纖頭安裝在五維調節(jié)架上，調節(jié)五維調節(jié)架能使進入光纖頭的超分辨信號光達到最大；

18、所述光纖頭的前端面的光纖內徑小于第二套筒鏡的后焦平面上的超分辨信號光的焦斑的第一零點半徑，從而更好保證超分辨成像分辨率達到最優(yōu)。

19、優(yōu)選的，所述光源模塊包括激光器和光纖準直器，激光器通過第一光纖跳線與光纖準直器連接；激光器發(fā)出的相干光經過第一光纖跳線傳輸至光纖準直器，光纖準直器將所述相干光準直后輸出準直激光束；

20、所述環(huán)形聚焦光束產生模塊還包括場鏡，所述場鏡的物方主面與第一正透鏡的后焦平面相重合，場鏡的像方主面分別與第二正透鏡的前焦平面相重合，以改變環(huán)形聚焦光束邊緣光線的傳播方向；以適應不同物鏡，使環(huán)形聚焦光束無阻擋地透射通過物鏡。

21、優(yōu)選的，所述光學顯微成像模塊包括非相干光源、準直透鏡、第一分束器、第二分束器、第三套筒鏡和數(shù)字相機，數(shù)字相機與計算機連接，非相干光源位于準直透鏡的前焦點處；非相干光源發(fā)出的光經準直透鏡準直、第一分束器反射后，依次經過第二分束器、四分之一波片到達物鏡，并在物鏡的前焦平面上匯聚成非相干光對樣品進行照明，由樣品反射和散射而產生的非相干光被物鏡收集后，依次經過四分之一波片、第二分束器、第一分束器、第三套筒鏡后進入數(shù)字相機，使樣品成像于數(shù)字相機上并通過相機信號線送入計算機，由計算機顯示樣品的寬場顯微圖像。從而方便對樣品進行寬場觀測，以確定所需的超分辨掃描成像區(qū)域。

22、優(yōu)選的，所述空間濾波器有三種結構。

23、第一種空間濾波器為環(huán)形通過型空間濾波器，其包括玻璃基底和覆蓋在所述玻璃基底上且同心的圓形鋁膜和第一環(huán)形鋁膜，所述圓形鋁膜的直徑等于2rin，所述第一環(huán)形鋁膜的內徑等于2rout、外徑等于所述玻璃基底的直徑，所述玻璃基底對波長為λ的光波透射率大于90%，所述圓形鋁膜、第一環(huán)形鋁膜對波長為λ的光波透射率都為0。只讓由樣品反射產生的超分辨信號光通過，即讓明場成像光信號通過，實現(xiàn)明場成像。其中，rin表示物鏡后焦平面處的圓形聚焦線的內半徑，rout表示物鏡后焦平面處的圓形聚焦線的外半徑。

24、第二種空間濾波器為環(huán)形遮擋型空間濾波器，其包括玻璃基底和覆蓋在玻璃基底上的第二環(huán)形鋁膜，所述第二環(huán)形鋁膜的內徑等于2rin、外徑等于2rout，所述玻璃基底對波長為λ的光波透射率大于90%，所述第二環(huán)形鋁膜對波長為λ的光波透射率為0。只讓由樣品散射產生的超分辨信號光通過，即讓暗場成像光信號通過，實現(xiàn)暗場成像。

25、第三種空間濾波器為相位板，其為在玻璃基底上表面制備一個厚度為t，內外半徑分別為rin和rout的一個空間濾波器，在rin和rout之間的圓環(huán)內波長為λ的光波的透射率t為10%-20%，相對于同高度的空氣其相位變化為π/4或-π/4。用于實現(xiàn)相襯成像。

26、第二方面，本發(fā)明所述的基于光錐照明的反射式掃描超分辨光學顯微方法，采用上述反射式掃描超分辨光學顯微系統(tǒng)，該方法包括：

27、步驟一、采用光學顯微成像模塊對樣品進行寬場成像，確定超分辨掃描成像區(qū)域；

28、步驟二、在確定超分辨掃描成像區(qū)域后，使環(huán)形聚焦光束產生模塊產生環(huán)形聚焦光束，超分辨聚焦照明與收集模塊將環(huán)形聚焦光束轉化為超分辨錐形聚焦光束，形成超分辨焦斑對樣品進行照明，收集由樣品反射和散射產生的超分辨信號光，分別匯聚和準直反射和散射的超分辨光信號，并完成偏振轉化；

29、步驟三、計算機控制樣品位移模塊帶動樣品移動至需要掃描的位置，并開啟光束掃描振鏡進行掃描，同時超分辨光學成像模塊獲取經準直、轉化后的超分辨信號光，并將其轉換為電信號輸入計算機；

30、步驟四、計算機對輸入的電信號進行處理，并結合超分辨照明焦斑在樣品移動的坐標x(t)和y(t)及對應時刻t光電倍增管獲得的信號光強度i(t)，形成超分辨掃描成像區(qū)域內樣品的超分辨顯微圖像i(x(t),y(t))。

31、本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

32、（1）高效超分辨聚焦照明：本發(fā)明通過精心設計的環(huán)形聚焦光束產生模塊，能夠高效地產生環(huán)形聚焦光束。隨后，利用超分辨聚焦照明與收集模塊，該環(huán)形聚焦光束被轉化為超分辨錐形聚焦光束，形成高精度的超分辨焦斑對樣品進行照明。這一過程充分利用了傳統(tǒng)透鏡聚焦效率高的優(yōu)勢，實現(xiàn)了高效的超分辨聚焦照明，顯著提升了成像的信噪比。同時，所產生的超分辨錐形聚焦光束，在物鏡后形成長焦深超分辨聚焦光場，便于減小照明光束、焦平面和樣品的對準要求。

33、（2）快速二維掃描：光束掃描模塊采用光束掃描振鏡技術，實現(xiàn)了光束的快速二維掃描。這種掃描方式不僅速度快，而且精度高，能夠在短時間內對大范圍區(qū)域進行超分辨成像。這一特點極大地提升了成像的效率，使得用戶能夠快速獲取大量高質量的圖像數(shù)據(jù)。

34、（3）非標記遠場超分辨顯微成像：與傳統(tǒng)的需要熒光分子標記的顯微技術相比，本發(fā)明的一大亮點在于其能夠實現(xiàn)未標記樣品的遠場超分辨二維顯微快速成像。這一功能不僅擴大了技術的適用范圍，還簡化了實驗步驟，降低了對樣品處理的要求。同時，由于工作距離大，使得在生物和工業(yè)檢測等領域的應用更加便捷和高效。

35、（4）三維層析成像能力：通過對不同軸向位置的樣品進行非標記遠場超分辨二維顯微成像，本發(fā)明能夠獲取樣品不同橫截面的超分辨二維顯微圖像，進而通過數(shù)據(jù)處理實現(xiàn)三維層析成像。這一功能對于分析樣品內部結構、揭示復雜樣品的空間分布具有重要意義，特別適用于生物醫(yī)學研究、材料科學等領域。

36、（5）高可靠性和成像質量：本發(fā)明通過精確控制各模塊之間的光路配合和信號處理過程，確保了成像的可靠性和穩(wěn)定性。從環(huán)形聚焦光束的產生、光束的掃描、超分辨聚焦照明到信號的收集和處理，每一個環(huán)節(jié)都經過精心設計和優(yōu)化，以保證最終成像質量的高水平。此外，采用的光學元件和信號采集設備均具有較高的性能指標，進一步提升了系統(tǒng)的整體性能和成像質量。

37、綜上所述，本發(fā)明基于光錐照明的反射式掃描超分辨光學顯微系統(tǒng)及方法，在高效超分辨聚焦照明、快速二維掃描、非標記遠場超分辨顯微成像、三維層析成像能力、超分辨三維成像能力以及高可靠性和成像質量等方面均表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，為生物醫(yī)學、工業(yè)檢測等領域提供了強有力的技術支持。