一種超分辨熒光光譜成像顯微鏡的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于圖像顯示技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種超分辨熒光光譜成像顯微鏡。
【背景技術(shù)】
[0002]在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中，超分辨熒光顯微鏡在研宄細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和各種生命規(guī)律中有著重要的應(yīng)用。但是，由于光學(xué)系統(tǒng)的限制，使得傳統(tǒng)的超分辨熒光顯微鏡存在衍射極限，導(dǎo)致其極限分辨率難以超越200nm。而超分辨熒光顯微技術(shù)能突破傳統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)中衍射極限的限制，進(jìn)一步的提高分辨率。利用超分辨熒光顯微鏡，可以使科學(xué)家們在分子水平上對活體細(xì)胞進(jìn)行研宄，如觀察活細(xì)胞內(nèi)生物大分子與細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞功能如何在分子水平表達(dá)及編碼，對于理解生命過程和疾病發(fā)生機(jī)理具有重要意義。
[0003]目前超分辨率熒光顯微技術(shù)雖然在圖像的分辨率上有所提高，但是對熒光檢測至關(guān)重要的波長信息，僅僅只是用濾光片進(jìn)行提取，這種做法無法在單次的檢測中區(qū)別出發(fā)不同波長的熒光團(tuán)。而且由于采用了面陣的CCD進(jìn)行信號采集，不可避免的會引入一些激發(fā)光的雜散信號。這些雜散信號雖然經(jīng)過濾光片的衰減，但有時仍然在強(qiáng)度上可比擬微弱的熒光信號。使得CCD在采集熒光信號時，無法區(qū)分激發(fā)光信號和熒光信號，導(dǎo)致樣本圖像受到影響，從而顯微成像的信噪比較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要目的在于提供一種提高熒光成像信噪比的超分辨熒光光譜成像顯微鏡。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種超分辨熒光光譜成像顯微鏡，其中，所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡包括激光發(fā)射器、雙色鏡、分光鏡、圖像控制器和光譜儀，所述激光發(fā)射器發(fā)射激發(fā)光至所述雙色鏡，所述雙色鏡將所述激發(fā)光反射至所述樣品，以激發(fā)樣品的熒光團(tuán)發(fā)出熒光，所述熒光具有熒光信號以及雜散信號，所述雙色鏡透過所述樣品的熒光至所述分光鏡，所述分光鏡將所述熒光分為第一束光路和第二束光路，所述第一束光路和所述第二束光路均具有所述熒光的熒光信號與雜散信號，所述第一束光路發(fā)射至所述圖像控制器，以采集所述熒光的強(qiáng)度信息，所述第二束光路發(fā)射至所述光譜儀，以分析所述熒光的光譜信息，并根據(jù)所述光譜信息區(qū)分所述熒光信號和所述雜散信號。
[0006]其中，所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡包括第一掃描組件和第二掃描組件，
[0007]所述第一掃描組件包括第一振鏡，所述第一振鏡接收所述雙色鏡反射的激發(fā)光，并反射激發(fā)光至所述樣品，所述第一振鏡還接收所述樣品的熒光，并反射所述熒光至所述雙色鏡；
[0008]所述第二掃描組件包括第二振鏡，所述第二振鏡將所述第一束光路掃描至所述圖像控制器。
[0009]其中，所述第一掃描組件還包括第一物鏡，所述第一物鏡將所述激發(fā)光聚焦于所述樣品上。
[0010]其中，所述第一掃描組件還包括第一組合透鏡，所述第一組合透鏡位于所述第一振鏡和所述第一物鏡之間，以改變所述激發(fā)光的光斑半徑。
[0011]其中，所述第二掃描組件還包括第二組合透鏡，所述第二組合透鏡透過所述第二振鏡的出射光，并發(fā)射至所述圖像控制器。
[0012]其中，所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡還包括第二物鏡、針孔和第三物鏡，所述第二物鏡將透過所述雙色鏡的熒光聚焦于所述針孔上，所述針孔透過所述熒光，并發(fā)射所述熒光至所述第三物鏡，所述第三物鏡將所述熒光恢復(fù)呈平行光束，并將所述平行光束發(fā)射至所述分光鏡。
[0013]其中，所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡還包括光學(xué)衰減片，所述光學(xué)衰減片將所述激光發(fā)射器發(fā)射的激發(fā)光衰減后，發(fā)射至所述雙色鏡。
[0014]其中，所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡還包括濾光片，所述濾光片將透過所述雙色鏡的熒光過濾后，發(fā)射至所述分光鏡。
[0015]其中，所述光譜儀設(shè)有采集所述第二路光束的接收端，所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡還包括第四物鏡，所述第四物鏡將所述第二路光束聚集于所述接收端。
[0016]其中，所述光譜儀設(shè)置有光纖，所述接收端設(shè)置于所述光纖上
[0017]本發(fā)明所提供的超分辨熒光光譜成像顯微鏡通過所述分光鏡將所述熒光分為第一束光路和第二束光路，利用所述第一束光路將樣品的熒光強(qiáng)度信息發(fā)射至所述圖像控制器，以實(shí)現(xiàn)樣品成像，同時利用第二束光路發(fā)送至所述光譜儀，利用所述光譜儀采集的光譜信息區(qū)分所述熒光中來自不同熒光團(tuán)的熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)利用光譜儀對樣品的圖像信息中的不同熒光團(tuán)加以區(qū)分，并且能將激發(fā)光與熒光信號從波長上區(qū)別開。從而降低熒光成像的信噪比，提高所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡的成像效果。
【附圖說明】
[0018]為了更清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施方式中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0019]圖1是本發(fā)明提供的超分辨熒光光譜成像顯微鏡的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施方式中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施方式中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。
[0021]請參閱圖1，本發(fā)明提供一種超分辨熒光光譜成像顯微鏡100。所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡100包括激光發(fā)射器10、雙色鏡20、分光鏡30、圖像控制器40和光譜儀50。所述激光發(fā)射器10發(fā)射激發(fā)光至所述雙色鏡20，所述雙色鏡20將所述激發(fā)光反射至所述樣品1，以激發(fā)樣品I的熒光團(tuán)發(fā)出熒光A，所述熒光A具有熒光信號以及激發(fā)光的雜散信號，所述雙色鏡20透過所述樣品I的熒光A至所述分光鏡30。所述分光鏡30將所述熒光A分為第一束光路Al和第二束光路A2，所述第一束光路Al發(fā)射至所述圖像控制器40，以采集所述熒光A的圖像信息，所述第二束光路A2發(fā)射至所述光譜儀50，以分析所述熒光A的光譜信息，并根據(jù)所述光譜信息區(qū)分所述熒光信號和所述雜散信號。
[0022]通過所述分光鏡30將所述熒光A分為第一束光路Al和第二書光路A2，利用所述第一束光路Al將樣品的圖像信息發(fā)射至所述圖像控制器40，以實(shí)現(xiàn)樣品成像，同時利用第二束光路A2發(fā)送至所述光譜儀50，利用所述光譜儀50采集的光譜信息區(qū)分所述熒光A中來自不同熒光團(tuán)的熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)利用光譜儀50對樣品的圖像信息中的不同熒光團(tuán)加以區(qū)分，并且能將激發(fā)光與熒光信號從波長上區(qū)別開。從而降低熒光成像的信噪比，提高所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡100的成像效果。
[0023]本實(shí)施方式中，所述激光發(fā)射器10發(fā)射的激發(fā)光對熒光團(tuán)進(jìn)行激發(fā)，即可激發(fā)熒光團(tuán)發(fā)出熒光，所述熒光的波長大于所述激發(fā)光的波長。對于不同的熒光團(tuán)可以選用不同波長的激發(fā)光，即對于不同的所述樣品I可以對所述激發(fā)光的波長進(jìn)行調(diào)節(jié)。所述激發(fā)光10的波長可通過所述激光發(fā)射器10進(jìn)行調(diào)節(jié)。對于不同的所述樣品I還可以調(diào)節(jié)所述激發(fā)光的光強(qiáng)，具體的，可以是調(diào)節(jié)所述激光發(fā)射器10的功率，從而實(shí)現(xiàn)所述激發(fā)光光強(qiáng)的調(diào)節(jié)。在其他實(shí)施方式中，所述激光發(fā)射器10還可以是對激發(fā)光的光束大小進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0024]本實(shí)施方式中，所述雙色鏡20可反射激發(fā)光并透過熒光。即所述雙色鏡20接收所述激光發(fā)射器10發(fā)射的激發(fā)光后，將所述激發(fā)光反射至所述樣品I。所述樣品I的熒光團(tuán)可以吸收所述激發(fā)光，并發(fā)出與所述激發(fā)光不同波長的所述熒光A，所述熒光A沿所述激發(fā)光的入射方向反向入射至所述雙色鏡20。從而所述雙色鏡20透過所述熒光A，所述熒光A的熒光信號和激發(fā)光雜散信號均透過所述雙色鏡20，其中，所述熒光信號可反映出所述樣品I的圖像。本實(shí)施方式中，所述分光鏡30既反射所述熒光A，又透過所述熒光A，從而實(shí)現(xiàn)熒光A被分為所述第一路光束Al和所述第二路光束A2，由于所述分光鏡30的吸收率低，所述分光鏡30對所述熒光A的熒光信號以及雜散信號影響較低，從而避免所述超分辨焚光光譜成像顯微鏡100失真。所述第一路光束Al由所述分光鏡30透過所述焚光A所形成，所述第二路光束A2由分光鏡30反射所述焚光A所形成。在其他實(shí)施方式中，所述第一路光束Al也可以由所述分光鏡30透過所述熒光A所形成，所述第二路光束A2也可以由所述分光鏡30反射所述焚光A所形成。
[0025]本實(shí)施方式中，所述圖像控制器40 (CCD，Charge-coupled Device)接收所述第一光束Al的光信號，即所述圖像控制器40可以采集所述熒光A的所述熒光信號以及所述雜散信號。所述圖像控制器40將所述熒光信號和所述雜散信號均轉(zhuǎn)換成電荷信號，電荷信號通過移位寄存器傳輸至模數(shù)轉(zhuǎn)換器，而后輸出至緩沖區(qū)組合成圖像信號。由于所述熒光A中具有所述雜散信號存在，所述雜散信號在所述圖像控制器40的圖像中表現(xiàn)圖像對比度降低，影響所述樣品I的圖像采集。即所述熒光A的所述熒光信號在所述圖像控制器40中被轉(zhuǎn)換成所述樣品I的圖像，所述熒光A的雜散信號在所述圖像控制器40中與信號光相疊加，影響所述樣品I的圖像的分辨率，降低了圖像的信噪比。在所述圖像控制器40的基礎(chǔ)上利用所述光譜儀50區(qū)分所述熒光A的熒光信號和雜散信號，從而實(shí)現(xiàn)對所述圖像控制器40的降噪，提高所述樣品I的成像信噪比，有效提高所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡100的成像效果。
[0026]本實(shí)施方式中，所述第二束光路A2中具有與所述第一束光路Al相同的焚光信號和雜散信號。所述光譜儀50從所述第二束光路A2中采集所述熒光A的熒光信號和雜散信號，由于所述雜散信號為從所述樣品I反射出的剩余激發(fā)光，所述雜散信號的波長與所述熒光信號的波長不同。所述光譜儀50可利用光電倍增管等光探測器測量光束的不同波長位置強(qiáng)度，即所述光譜儀50可分離出需要的波長，以及需要的波長區(qū)域，即所述光譜儀50根據(jù)需要可分離出所述熒光信號或者所述雜散信號，以及可分離出所述熒光信號的強(qiáng)度，或分離出所述雜散信號的強(qiáng)度。從而在所述圖像控制器40中可去掉所述雜散信號，提高所述樣品I的熒光成像信噪比，使得所述超分辨熒光光譜成像顯微鏡100的使用效率提高。在其他實(shí)施方式中，還可以是將所述光譜儀50與所述圖像控制器40相結(jié)合，從而利用所述光譜儀50的光譜信息以檢測出多種形式的所述樣品I的熒光。
[0027]進(jìn)一步地，所述超分辨焚光光譜成像顯微鏡100包括第一掃描組件60和第二掃描組件70。所述第一掃描組件60包括第一振鏡61，所述第一振鏡接61接收所述雙色鏡20反射的激發(fā)光，并反射激發(fā)光斑至所述樣品1，所述第一振鏡61還接收所述樣品I的熒光A，并反射所述熒光A至所述雙色鏡20 ;所述第二掃描組