用于分析透明或低對(duì)比度樣本的自動(dòng)顯微鏡聚焦系統(tǒng)和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明大體涉及顯微鏡，且更特定來(lái)說(shuō)涉及用于憑經(jīng)驗(yàn)確定聚焦在透明或低對(duì)比度樣本上的物鏡的焦點(diǎn)的工作距離和深度的顯微鏡系統(tǒng)和方法。本發(fā)明提供可有益地聚焦在透明或低對(duì)比度樣本的經(jīng)界定深度上的顯微鏡系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]所有光學(xué)顯微鏡都需要借以提供聚焦以便清楚地使樣本成像的機(jī)構(gòu)。在許多情形中，系統(tǒng)聚焦取決于樣本具有視覺(jué)上可辨識(shí)的特征。這些特征產(chǎn)生用于聚焦的必要對(duì)比度。在其它情形中，確定到樣本的距離，且通過(guò)物鏡的已知焦長(zhǎng)設(shè)定焦點(diǎn)。透明樣本為建立適當(dāng)聚焦提出了特殊挑戰(zhàn)，且需要僅本領(lǐng)域極其熟練的技術(shù)人員已知的特別的技術(shù)來(lái)改進(jìn)到可能發(fā)生適當(dāng)聚焦的點(diǎn)的對(duì)比度。
[0003]顯微鏡傳統(tǒng)上通過(guò)增加或減小顯微鏡物鏡與樣本之間的距離直到圖像對(duì)于顯微鏡人員呈現(xiàn)為焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)為止來(lái)進(jìn)行聚焦。顯微鏡的聚焦因此通常某種程度上具有主觀性，且顯微鏡必須具有焦點(diǎn)調(diào)整能力以便適當(dāng)視覺(jué)化樣本的表面特征。更通常的做法是，提供旋鈕以移動(dòng)物鏡或固持樣本的載物臺(tái)以便調(diào)整物鏡與樣本之間的相對(duì)距離，且顯微鏡人員操縱此旋鈕直到他主觀上相信已達(dá)到最佳聚焦為止。因此，盡管需要更加精細(xì)的準(zhǔn)確度，但顯微鏡人員基本上維持借以主觀上確定聚焦的主觀工具。
[0004]技術(shù)已通過(guò)兩種基本方法將主觀性排除出聚焦的確定。第一方法通過(guò)感測(cè)從樣本表面反射的光(例如，近紅外)來(lái)測(cè)量物鏡與樣本之間的距離以提供反饋來(lái)自動(dòng)控制聚焦。此類型的方法由尼康(Nikon)公司(日本)描述。在另一方法中，尼康公司還描述使用經(jīng)反射聲音來(lái)測(cè)量距離。如Mot1nX公司(美國(guó))例如在其FocusTrac Laser Auto FocusSystems, and Pr1r Scientif ic (美國(guó))中描述的激光聚焦控制系統(tǒng)還通過(guò)測(cè)量物鏡與樣本之間的距離且提供反饋用于焦點(diǎn)調(diào)整來(lái)促進(jìn)聚焦。美國(guó)專利N0.7，345，814進(jìn)一步描述激光聚焦系統(tǒng)。在一些情況下，這些方法歸因于樣本反射性和透明度而在透明樣本上聚焦時(shí)存在困難。這些距離測(cè)量方法通常需要添加硬件和控制軟件以促進(jìn)使用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡進(jìn)行聚焦。美國(guó)專利N0.5，594，235使用共焦傳感器來(lái)最佳測(cè)量高度或Z軸點(diǎn)(如其在現(xiàn)有技術(shù)中所提及)。預(yù)先確定給定數(shù)目的z點(diǎn)，且接著評(píng)估每一者的反射率。歸因于不同程度的反射率，可確定表面的每一點(diǎn)處的高度。雖然此可視為最高點(diǎn)測(cè)量的工具，但其還確保聚焦準(zhǔn)確性的特定置信度。
[0005]使顯微鏡聚焦的第二已知方法是隨著顯微鏡物鏡與樣本之間的距離增加和減小而比較圖像的對(duì)比度。這基本上是顯微鏡人員用于視覺(jué)上確定樣本處于焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)(如上所述)的方法。所述方法容易通過(guò)使用例如(但不限于)C⑶或CMOS傳感器等傳感器以電子方式俘獲樣本圖像而自動(dòng)化。此方法由Groen和Young等人在“A Comparison of DifferentFocus Funct1ns for Use in Autofocus Algorithms，，Cytometry 6:81-91 (1985)中詳細(xì)描述。然而，此對(duì)比度比較方法不能在完全透明或在圖像內(nèi)不具有對(duì)比度的樣本上使用。
[0006]采用使用顯微鏡的景孔徑(F制光圈，F(xiàn)-Stop)的方法在樣本上聚焦。此方法由Chow和Liu描述，尼康光學(xué)顯微鏡，基本操作程序，http://nanomech.me.Washington,edu/pdfs/nikon.pdf，2009 年 I 月，且進(jìn)一步在耐諾(Nanometrics)公司的 NanoSpec?3000實(shí)驗(yàn)室指南，NanoSpec Film Thickness Measurement System，第 8.33 章中描述。在此方法中，F(xiàn)制光圈關(guān)閉以便將F制光圈投影在樣本上，且調(diào)整焦點(diǎn)(即，相對(duì)移動(dòng)樣本和物鏡)使得對(duì)比度增加和/或減小。在最大對(duì)比度點(diǎn)處，樣本視為處于焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)且F制光圈打開(kāi)以允許樣本的成像。
[0007]在顯微鏡成像過(guò)程中，樣本主要經(jīng)由物鏡放大。每一物鏡具有相關(guān)聯(lián)景深，有時(shí)也稱為焦深。尼康公司將景深界定為從處于焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的最近物平面到也同時(shí)處于焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的最遠(yuǎn)平面的距離。在顯微鏡學(xué)中，景深是從近似0.2到55微米(μπι)的極短范圍。應(yīng)了解，當(dāng)使透明樣本成像時(shí)，景深內(nèi)的任何物體將被成像。舉例來(lái)說(shuō)，使用參考6中的數(shù)據(jù)，4倍物鏡具有55.5 μπι的景深，且因此當(dāng)其聚焦在透明樣本上且最近處于焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的物平面在樣本表面處時(shí)，樣本的頂部55.5 μ m內(nèi)的所有物體將被成像。當(dāng)例如所關(guān)注區(qū)域僅是樣本的頂部5 μπι時(shí)，這不合需要。因此，本領(lǐng)域中需要一種允許顯微鏡在所要深度自動(dòng)聚焦在透明或半透明樣本上從而視需要取消物鏡的景深的其余部分的顯微鏡系統(tǒng)。本領(lǐng)域中需要提供允許使透明或低對(duì)比度樣本在所要深度自動(dòng)成像的顯微鏡系統(tǒng)和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的一實(shí)施方案提供一種用于憑經(jīng)驗(yàn)確定顯微鏡系統(tǒng)的物鏡的景深的邊界的方法，所述顯微鏡系統(tǒng)具有顯微鏡、F制光圈，以及一或多個(gè)處理器，所述方法包括以下步驟:
將樣本的焦面放置在物鏡的景深外部的第一位置處；
在第一位置處將F制光圈投影到焦面上以在其上產(chǎn)生F制光圈投影；
實(shí)行樣本與物鏡之間的遞增相對(duì)移動(dòng)以將樣本的焦面相對(duì)于物鏡放置在不同遞增位置處，且投影F制光圈以在所述遞增位置處在焦面上產(chǎn)生F制光圈投影，其中所述實(shí)行遞增相對(duì)移動(dòng)的步驟將焦面帶至景深的邊界處的位置；
執(zhí)行第一位置處以及所述遞增位置處F制光圈投影的圖像的對(duì)比度分析，所述執(zhí)行對(duì)比度分析的步驟由所述一或多個(gè)處理器實(shí)行且確立焦面何時(shí)處于景深的邊界處的位置處。
[0009]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0008]中的方法，其中樣本是透明的且焦面選自近焦面(相對(duì)于物鏡)和遠(yuǎn)焦面(相對(duì)于物鏡)。
[0010]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0008]或
[0009]中的方法，其中景深具有第一邊界WD和第二邊界WD1，其中WD是焦面可距物鏡的且仍處于明確焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的最短距離，且WD1是焦面可距物鏡的且仍處于明確焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的最大距離，且第一位置經(jīng)選擇為小于WD的99%或大于101%的距離。
[0011]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0008]到
[0010]的任一者中的方法，其中所述執(zhí)行對(duì)比度分析的步驟通過(guò)比較多個(gè)遞增位置處F制光圈投影的相對(duì)焦點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差而確立焦面何時(shí)處于景深的邊界處的位置處。
[0012]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0008]到
[0011]的任一者中的方法，其中所述投影F制光圈的步驟由所述一或多個(gè)處理器自動(dòng)化。
[0013]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0008]到
[0012]的任一者中的方法，其中所述實(shí)行遞增相對(duì)移動(dòng)的步驟由所述一或多個(gè)處理器自動(dòng)化。
[0014]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0008]到
[0013]的任一者中的方法，其中所述放置步驟由所述一或多個(gè)處理器自動(dòng)化。
[0015]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0008]到
[0014]的任一者中的方法，其中第一位置由顯微鏡系統(tǒng)的用戶輸入。
[0016]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0008]到
[0015]的任一者中的方法，其中物鏡具有制造商陳述的工作距離，且所述第一位置基于所述制造商陳述的工作距離而選擇，如顯微鏡系統(tǒng)的用戶所輸入。
[0017]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0008]到
[0016]的任一者中的方法，其中顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)一步包括圖像傳感器，且所述方法進(jìn)一步包括:以電子方式利用圖像傳感器使F制光圈投影在所述遞增位置處在焦面上成像，所述以電子方式成像的步驟由所述一或多個(gè)處理器自動(dòng)化。
[0018]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于使透明樣本在頂部焦面下方的所界定深度處或在底部焦面上方的所界定高度處成像的方法，所述方法包括以下步驟:
憑經(jīng)驗(yàn)確定顯微鏡系統(tǒng)的物鏡的景深的邊界，所述顯微鏡系統(tǒng)具有顯微鏡、F制光圈，以及一或多個(gè)處理器，所述憑經(jīng)驗(yàn)確定邊界的步驟包括以下步驟:
將樣本的焦面放置在物鏡的景深外部的第一位置處，
在第一位置處將F制光圈投影到焦面上以在其上產(chǎn)生F制光圈投影，
實(shí)行樣本與物鏡之間的遞增相對(duì)移動(dòng)以將樣本的焦面相對(duì)于物鏡放置在不同遞增位置處，且在所述遞增位置處投影F制光圈以在焦面上產(chǎn)生F制光圈投影并在焦面上使F制光圈投影的圖像成像，其中所述實(shí)行遞增相對(duì)移動(dòng)的步驟將焦面帶至景深的邊界處的位置，以及
執(zhí)行第一位置處以及所述遞增位置處F制光圈投影的圖像的對(duì)比度分析，所述執(zhí)行對(duì)比度分析的步驟由所述一或多個(gè)處理器實(shí)行且確立焦面何時(shí)處于景深的邊界處的位置處；以及
基于所述確定邊界的步驟中所確定的景深的邊界將透明樣本的焦面放置在景深內(nèi)。
[0019]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0018]中的方法，其中景深具有第一邊界WD和第二邊界WD1，其中WD是焦面可距物鏡的且仍處于明確焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的最短距離，且WD1是焦面可距物鏡的且仍處于明確焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的最大距離，且所述利用景深放置透明樣本的焦面的步驟包括將頂部焦面放置成比WD1更接近物鏡或?qū)⒌撞拷姑娣胖贸杀萕D更遠(yuǎn)離物鏡。
[0020]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0018]或
[0019]中的方法，其中景深具有第一邊界WD和第二邊界WD1，其中WD是焦面可距物鏡的且仍處于明確焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的最短距離，且WD1是焦面可距物鏡的且仍處于明確焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)的最大距離，且第一位置經(jīng)選擇為小于WD的99%或大于101%的距離。
[0021]本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種如段落
[0018]到
[0020]的任一者中的方法，其中所述執(zhí)行對(duì)比度分析的步驟通過(guò)比較多個(gè)遞增位置處F制光圈投影的相對(duì)焦點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)