一種微納照明下的多重散射超分辨顯微方法與裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及超分辨顯微領(lǐng)域,尤其涉及一種微納照明下的多重散射超分辨顯微方 法與裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 由阿貝衍射極限理論可知,常規(guī)遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡的極限分辨率可表示為
其中λ為所用照明光的波長(zhǎng),NA為所用顯微物鏡的數(shù)值孔徑。因此,在可見(jiàn)光 波段,光學(xué)顯微鏡的分辨率被限制在200納米左右。然而,隨著生物醫(yī)學(xué)等技術(shù)的發(fā)展,研 究人員們已經(jīng)開(kāi)始對(duì)生物組織和細(xì)胞在納米尺度上進(jìn)行分析,所觀察的樣品性質(zhì)也多種多 樣,因此需要一種對(duì)樣品的普適性強(qiáng)的可以突破常規(guī)衍射極限的新技術(shù),來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨顯 微。
[0003] 衍射極限限制分辨率也可以從傅利葉頻譜的角度進(jìn)行分析,即二維物體都是由一 系列角譜按照相應(yīng)的權(quán)重疊加而成的。其中高頻分量對(duì)應(yīng)的是物體的細(xì)節(jié)信息,但由于光 波的波矢有限,無(wú)法承載這些高頻信息到達(dá)遠(yuǎn)場(chǎng),而只能以倏逝波的形式在近場(chǎng)存在。所謂 的超分辨即將這些高頻信息從近場(chǎng)提取出來(lái)。比如SNOM技術(shù),是通過(guò)近場(chǎng)探針與樣品表面 相互作用來(lái)提取近場(chǎng)信息。再比如SIL技術(shù),是通過(guò)大折射率固體浸沒(méi)使光波波矢增加,使 近場(chǎng)更多的高頻信息可以從倏逝波的形式變?yōu)樾胁▊鞯竭h(yuǎn)場(chǎng)。但以上技術(shù)或者需要昂貴的 設(shè)備和復(fù)雜的后續(xù)處理,或者對(duì)應(yīng)的分辨率相對(duì)有限。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明從一種全新的角度出發(fā),提出利用微納照明下的多重散射效應(yīng)來(lái)提取近場(chǎng) 信息。該方法簡(jiǎn)易、快捷、可靠,通過(guò)微納光源與樣品結(jié)構(gòu)相互作用,使樣品的頻譜發(fā)生縮 放,高頻變?yōu)榈皖l傳到遠(yuǎn)場(chǎng),在樣品表面以下形成一放大的虛像,并得到λ/10以上的分辨 率。在本發(fā)明的多重散射超分辨顯微方法中,包括如何使微納光源與待分辨結(jié)構(gòu)相互作用、 如何得到所有方向的高頻分量、如何對(duì)輸出結(jié)果進(jìn)行處理。
[0005] -種微納照明下的多重散射超分辨顯微方法,包括以下步驟:
[0006] 1)利用微納光源作用于具有單一空間頻率的微納結(jié)構(gòu)樣品(如光柵),使微納結(jié) 構(gòu)樣品內(nèi)部發(fā)生多重散射;
[0007] 2)通過(guò)顯微鏡對(duì)微納結(jié)構(gòu)樣品進(jìn)行光場(chǎng)成像,并對(duì)像進(jìn)行頻譜分析,得到所述微 納光源的頻移量;
[0008] 3)更換不同的具有單一空間頻率的微納結(jié)構(gòu)樣品,重復(fù)步驟1)和步驟2)中的操 作,利用微納光源在各空間頻率下的頻移量建立頻移數(shù)據(jù)庫(kù);
[0009] 4)利用所述的微納光源觀察待測(cè)樣品,并對(duì)出射光的方向進(jìn)行360度的掃描或?qū)?待測(cè)樣品進(jìn)行360度的照射,在掃描或照射過(guò)程中應(yīng)用與步驟2)中相同的顯微鏡進(jìn)行成 像,得到相應(yīng)的頻移圖像;
[0010] 5)根據(jù)所述的頻移數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)頻移圖像進(jìn)行頻譜還原和重構(gòu),得到待測(cè)樣品的超 分辨顯微圖像。
[0011] 多重散射是指樣品中的每一散射點(diǎn)都可以作為發(fā)射球面波的子波源,發(fā)射的子球 面波相互疊加后重新分布于物體中,之后每一點(diǎn)再作為子波源對(duì)新的光場(chǎng)產(chǎn)生散射,如此 循環(huán)下去,最終得到穩(wěn)定存在的散射場(chǎng)。多重散射場(chǎng)會(huì)將物體高頻信息傳達(dá)到遠(yuǎn)場(chǎng)。然而, 一般的光學(xué)顯微照明方式會(huì)引入相當(dāng)多的噪聲,使由多重散射所加載的高頻信息完全被淹 沒(méi),難以提取。微納結(jié)構(gòu)由于尺度上與光波長(zhǎng)可比擬,它所提供的照明則可以有效地壓制噪 聲,使多重散射對(duì)高頻信息的加載和提取變得簡(jiǎn)單易操作,且具有分辨率高、實(shí)時(shí)成像、裝 置簡(jiǎn)單、處理方便、信噪比好等特點(diǎn),可以很好地應(yīng)用于熒光及非熒光樣品的檢測(cè)之中。
[0012] 在本發(fā)明中,微納光源有多種實(shí)施方式,在這里我們提供幾種優(yōu)選的實(shí)施方式:
[0013] 優(yōu)選的,所述的微納光源為內(nèi)部定向傳輸有耦合光的平板波導(dǎo),其厚度小于1微 米,所述的微納結(jié)構(gòu)樣品和待測(cè)樣品置于或嵌入所述的平板波導(dǎo)表面。
[0014] 優(yōu)選的,所述的微納光源為內(nèi)部通有耦合光的微納光纖,其直徑小于1微米,所述 微納光纖的出射光用于照亮所述的微納結(jié)構(gòu)樣品和待測(cè)樣品。
[0015] 并列優(yōu)選的,所述的微納光源為受外界激發(fā)產(chǎn)生自發(fā)輻射的納米線(xiàn),微納結(jié)構(gòu)樣 品和待測(cè)樣品被納米線(xiàn)的出射光照亮,或者所述的納米線(xiàn)環(huán)繞樣品并沿樣品輪廓進(jìn)行彎 曲。
[0016] 其中,微納光纖和平板波導(dǎo)為被動(dòng)發(fā)光的微納裝置,需要將外界光耦合到其中并 保證傳播,半導(dǎo)體納米線(xiàn)可主動(dòng)發(fā)光,需要搭建激發(fā)光路使其自發(fā)輻射。采用平板波導(dǎo),微 納光源與待觀察結(jié)構(gòu)相互作用,需使微納波導(dǎo)表面與待觀察結(jié)構(gòu)緊密貼合;若采用微納光 纖或納米線(xiàn),需調(diào)整微納光源的出射方向及其與樣品之間的距離,才能使樣品內(nèi)部發(fā)生有 效散射。
[0017] 納米線(xiàn)作為微納光源進(jìn)行觀察時(shí),要求納米線(xiàn)表面形貌良好,直徑在1微米以下, 可根據(jù)樣品對(duì)納米線(xiàn)直徑的選擇進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。納米線(xiàn)的材料可以是單一半導(dǎo)體材料比如 CdS、CdSe、GaN、ZnO,也可以是摻雜、引入缺陷或多元半導(dǎo)體材料。
[0018] 同時(shí),本發(fā)明還提供了一種微納照明下的多重散射超分辨顯微裝置,包括:
[0019] 微納光源,用于使樣品內(nèi)部發(fā)生多重散射,抑制噪聲;
[0020] 顯微鏡,用于對(duì)發(fā)生多重散射后的樣品進(jìn)行光場(chǎng)成像,得到頻移圖像;
[0021] CXD :用于能顯微鏡成像進(jìn)行拍照;
[0022] 計(jì)算機(jī),用于對(duì)頻移圖像進(jìn)行頻譜分析,建立頻移數(shù)據(jù)庫(kù);以及后續(xù)樣品圖的還原 和重構(gòu),得到超分辨顯微圖像。
[0023] 優(yōu)選的,所述的微納光源為內(nèi)部定向傳輸有f禹合光的平板波導(dǎo),所述樣品置于或 嵌入所述的平板波導(dǎo)表面,該平板波導(dǎo)的底部依次設(shè)有反射層和波導(dǎo)襯底,也可以選擇合 適材料既充當(dāng)反射層也充當(dāng)襯底;襯底及其上微納波導(dǎo)、樣品結(jié)構(gòu)放在顯微鏡的載物臺(tái)上。 耦合光在可見(jiàn)或近紫外波段,平板波導(dǎo)厚度要在1微米以下,可從幾百納米到幾十納米不 等。厚度變小,分辨率會(huì)變高,但同時(shí)波導(dǎo)的傳導(dǎo)能力會(huì)變差,可能會(huì)限制到觀察的空間范 圍。
[0024] 襯底的選擇可以透明也可以不透明,它的作用主要是支撐微納裝置。但在需要為 波導(dǎo)提供反射面且反射層就由襯底本身來(lái)充當(dāng)?shù)那闆r下,最好選擇與波導(dǎo)層折射率差大的 材料作為襯底。
[0025] 并列優(yōu)選的,所述的微納光源為內(nèi)部通有耦合光的微納光纖,直徑小于1微米,顯 微鏡的載物臺(tái)上設(shè)有襯底,所述的樣品置于或嵌入襯底表面。
[0026] 微納光纖作為一種一維微納結(jié)構(gòu),方便轉(zhuǎn)移和操縱。微納光纖通光后,使其端頭與 待觀察結(jié)構(gòu)靠近,并調(diào)整端頭和結(jié)構(gòu)之間的距離及光注入的方向,使得光場(chǎng)以盡可能大的 橫向分量,盡可能小的場(chǎng)變形注入到結(jié)構(gòu)上,同樣在結(jié)構(gòu)內(nèi)部發(fā)生多重散射,疊加后的總光 場(chǎng)傳到遠(yuǎn)場(chǎng)被顯微物鏡、目鏡成像,構(gòu)成一個(gè)位于二維物體表面下方的放大的虛像。由于 通過(guò)這種方法引入的倏逝波方向比較純粹,因此有效地避免了不同空間高頻分量之間的串 擾。
[0027] 當(dāng)通在光纖里的光頻較為單一時(shí),比如激光,那么光場(chǎng)在樣品結(jié)構(gòu)上發(fā)生多重散 射的過(guò)程中會(huì)有較為明顯的干涉效應(yīng),在得到最終的超分辨圖像過(guò)程中,需要通過(guò)圖像處 理消除產(chǎn)生的干涉條紋,如果選擇通寬波段的光進(jìn)行照明,則可得到更為清晰干凈的圖像。
[0028] 并列優(yōu)選的,所述的微納光源為受外界激發(fā)產(chǎn)生自發(fā)輻射的納米線(xiàn),所述顯微鏡 的顯微物鏡和顯微目鏡之間設(shè)有半透半反鏡,用于照明光與激發(fā)光之間的光路切換。
[0029] 將納米線(xiàn)通過(guò)分子間作用力或更為穩(wěn)固的粘合工藝使其與可三維移動(dòng)的精密裝 置連接,將顯微鏡的照明光換成激發(fā)波段的光以激發(fā)納米線(xiàn)發(fā)生自發(fā)輻射,從納米線(xiàn)端頭 出射的寬范圍熒光在樣品結(jié)構(gòu)上多重散射。這樣省去了需要將照明微納光纖與外界激光耦 合相連的麻煩,使微納光纖操縱起來(lái)更加自由。
[0030] 以上兩種優(yōu)選方法無(wú)需對(duì)觀察樣品進(jìn)行處理,而只需要靈活地操縱通光或自身發(fā) 光的微納光纖,調(diào)整其位置與方向?qū)悠愤M(jìn)行掃描,最終便可得到包含各個(gè)方向高頻信息 的超分辨圖像。
[0031] 進(jìn)一步優(yōu)選的,所述的納米線(xiàn)和樣品放置在襯底波導(dǎo)層上,且該納米線(xiàn)環(huán)繞樣品 沿樣品輪廓彎曲布置,該襯底波導(dǎo)層的底部為反射層或反射層和襯底層。
[0032] 在這種情況中,納米線(xiàn)與多層襯底結(jié)合引入雙重光路。將納米線(xiàn)置于硅基亞波長(zhǎng) 二氧化硅層襯底上,并引入激發(fā)光使納米線(xiàn)發(fā)生自發(fā)輻射,此時(shí)襯底上分布于納米線(xiàn)周?chē)?的結(jié)構(gòu)由于受到納米線(xiàn)微納光源的照明,沿照明光方向的高頻信息便可實(shí)現(xiàn)超分辨。同時(shí) 襯底表面仍會(huì)有一層倏逝波的存在,方向與納米線(xiàn)熒光方向一致。由于納米線(xiàn)材料的折射 率高,表面倏逝波的橫向分量往往也較大,橫向分量的增大可以有效地對(duì)分辨率進(jìn)行提高。
[0033] 沿著納米線(xiàn)熒光方向的倏逝波分量處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì),如果通過(guò)調(diào)整納米線(xiàn)的方位來(lái) 調(diào)控倏逝波方向,使其方向與超過(guò)衍射極限的高頻分量的方向一致,就可以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)高頻 分量的超分辨。
[0034] 本方案中的核心元件納米線(xiàn)的直徑設(shè)置為200nm-400nm,具有非常大的表面積與 體積比,非常柔軟,而其長(zhǎng)度則可高達(dá)幾十微米甚至幾百微米,因此可以根據(jù)所要觀察的物 體的輪廓而隨意彎曲成最適宜觀察的形狀,從而實(shí)現(xiàn)精細(xì)物體的高分辨全貌觀察。
[0035] 本方案中的多層襯底要求放置樣品的波導(dǎo)層厚度在1微米以下。
[0036] 利用微納光纖與納米線(xiàn)之間的相互作用力,可以方便地實(shí)現(xiàn)納米線(xiàn)的空間轉(zhuǎn)移和 彎曲,而且由于納米線(xiàn)與襯底之間較強(qiáng)的相互吸引力,使得納米線(xiàn)被彎曲后無(wú)需再借助任 何其它的外力使其保持相應(yīng)的形狀,從而使得超分辨觀察變得非常方便、簡(jiǎn)易、可靠性高、 穩(wěn)定性強(qiáng)。
[0037] 另外,本發(fā)明也可以采用納米線(xiàn)粘合工藝,將納米線(xiàn)圍成一個(gè)圓以提供所有二維 方向上的照明,并與一三維精密移動(dòng)裝置連接,以對(duì)樣品進(jìn)行大范圍掃描全貌成像。
[0038] 本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0039] 1、實(shí)現(xiàn)了二維超分辨,分辨能力在λ /10以上;
[0040] 2、對(duì)樣品的類(lèi)型沒(méi)有特殊要求,既可以是熒光樣品也可以是非熒光樣品;
[00