用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備的制造方法
【專利說明】用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備。這種設(shè)備包括用于容納位于介質(zhì)中的 樣本的樣本容器，其中，樣本容器相對于平面形參照面被對齊。該設(shè)備還包括具有照明物鏡 的照明光學(xué)系統(tǒng)，用于以光片照明樣本，其中，照明物鏡的光學(xué)軸線與光片位于這樣的平面 中，該平面與參照面的法線圍成不等于0的照明角度β。該設(shè)備還包括具有檢測物鏡的檢 測光學(xué)系統(tǒng)，檢測物鏡的光學(xué)軸線與參照面的法線圍成不等于〇的檢測角度S。照明物鏡 和檢測物鏡在此也可以構(gòu)建為所謂的雙物鏡，如例如在ΕΡ 0 866 993 Β1中所描述的那樣。 兩個物鏡于是綜合在共同的結(jié)構(gòu)單元中，于是，各個光學(xué)系統(tǒng)，即物鏡及其所屬的光路和位 于其中的光學(xué)元件，共享一些元件。
[0002] 這種設(shè)備尤其在檢查生物樣本時使用，在該檢查中，以光片照明樣本，光片的平面 與檢測的光軸線以不等于0的角度相交。通常在此，光片與通常為檢測物鏡的光軸線的檢 測方向圍成直角。借助該也稱作SPIM(Selective Plane Illumination Microscopy選擇 性平面照明顯微鏡）的技術(shù)可以在較短時間中也建立較厚樣本的空間記錄?；诠鈱W(xué)剖切 結(jié)合在垂直于剖面的方向上的相對運動，可以以圖像方式、空間延展地示出樣本。
[0003] SP頂技術(shù)優(yōu)選用于熒光顯微鏡，在那里該技術(shù)也稱作LSFM (Light Sheet Fluorescence Microscopy光片焚光顯微鏡）。相對于諸如共焦激光掃描顯微鏡或二光子 顯微鏡的其它已知方法而言，LSFM技術(shù)具有多個優(yōu)點：因為檢測可以在寬視場中進行，所 以可以采集更大的樣本區(qū)域。雖然分辨率比共焦激光掃描顯微鏡小一些，但是用LSFM技術(shù) 還可以分析更厚的樣本，因為進入深度更大。此外，在該方法中，樣本的光負(fù)荷是最小的，這 尤其降低了使樣本褪色的風(fēng)險，因為樣本僅通過與檢測方向成不為〇的角度的薄光片被照 射。
[0004] 在此，不僅能使用例如借助圓柱透鏡產(chǎn)生的靜態(tài)光片，還能使用準(zhǔn)靜態(tài)光片。該準(zhǔn) 靜態(tài)光片可以通過用于光束迅速掃描樣本的方式來產(chǎn)生。通過使光束經(jīng)歷相對于待觀察樣 本的極為快速的相對運動以及在此時間上相繼地多次連續(xù)進行，形成了光片狀的照明。在 此，將其上的傳感器最終成像樣本的相機的積分時間（Integrationszeit)選擇為使得掃 描在積分之間內(nèi)完成。替代具有2D陣列的相機，還可以使用結(jié)合檢測光學(xué)系統(tǒng)中的重新掃 描（Rescan)的陣列傳感器。該檢測還可以共焦地進行。
[0005] SP頂技術(shù)如今在文獻中被多次描述，例如在DE 102 57 423 A1和基于其的TO 2004/053558 A1 中或者在概覽性文章"Selective Plane Illumination Microscopy Techniques in Developmental Biology發(fā)育生物學(xué)中的選擇性平面照明顯微鏡技術(shù)"， J. Huisken 等著，發(fā)表于 2009 年，雜志 Development，136 卷，1963 頁中。
[0006] 光片顯微鏡的主要應(yīng)用之一在于成像平均尺寸的、大小為100 ym至數(shù)毫米的有 機體。通常，這些有機體嵌入在瓊脂糖凝膠中，其又位于玻璃毛細(xì)管中。玻璃毛細(xì)管被從上 方或下方引入到裝有水的樣本室中，并且將樣本從毛細(xì)管中擠出一段。用光片照明瓊脂糖 中的樣本，并且用垂直于光片和由此也垂直于光片光學(xué)系統(tǒng)的檢測物鏡將熒光在照相上成 像。光片顯微鏡的該方法具有三個大不利。首先，待檢查的樣本比較大，它源自發(fā)育生物 學(xué)。此外，由于樣本準(zhǔn)備和樣本室的尺寸，光片較厚并且由此限制了可達(dá)到的軸向分辨率。 再者，樣本準(zhǔn)備是麻煩的，與在熒光顯微鏡用于檢查單個細(xì)胞時常用的標(biāo)準(zhǔn)樣本準(zhǔn)備和標(biāo) 準(zhǔn)樣本保持也不兼容。
[0007] 為了能夠至少部分地避開這些限制，近年來實現(xiàn)了 SP頂結(jié)構(gòu)，其中照明物鏡和檢 測物鏡相互垂直，并且分別以45°的角度從上方指向樣本。如果例如將樣本保持部位于其 上的桌面或者另一水平面看做參照面，則照明角度β和檢測角度δ分別為45°。這種結(jié) 構(gòu)例如在 W0 2012/110488 Α2 和在 W0 2012/122027 Α2 中被描述。
[0008] 樣本在這種結(jié)構(gòu)中例如位于皮氏培養(yǎng)皿的底板上。該皮氏培養(yǎng)皿裝有水，照明物 鏡和檢測物鏡浸泡在該液體中，水也承擔(dān)了浸沒液體的功能。該方法提供了在軸向上較高 分辨率的優(yōu)點，因為可以產(chǎn)生更薄的光片。由于該更高的分辨率，于是可以檢查更小的樣 本。樣本準(zhǔn)備也變得簡單很多。然而，樣本準(zhǔn)備和樣本保持還是非標(biāo)準(zhǔn)的，該標(biāo)準(zhǔn)如在熒光 顯微學(xué)在單個細(xì)胞情況下如今適用。于是皮氏培養(yǎng)皿必須較大，以便將兩個物鏡都浸泡在 該培養(yǎng)皿中，而不撞到培養(yǎng)皿的邊緣。微量滴定板，也稱作多孔板是在生物學(xué)很多領(lǐng)域中 的標(biāo)準(zhǔn)并且恰也在對單個細(xì)胞的熒光顯微學(xué)分析中使用，微量滴定板在所述方法中無法使 用，因為物鏡不能以被浸到格柵狀布置在板上的很小的凹處中。另一缺點在于，用該構(gòu)造難 以短時內(nèi)分析多個樣本（高通量篩選技術(shù)），因為物鏡在樣本變更時必須被清潔，以避免不 同樣本間的污染。
[0009] 本發(fā)明的任務(wù)在于改進開頭所述類型的用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備，使得尤其簡化 對大量樣本的分析，方法是，在兩個樣本間更換時有效避免交叉污染。
[0010] 該任務(wù)在開頭描述類型的用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備中這樣解決，即，該設(shè)備包括 具有一個或多個厚度預(yù)定且材料預(yù)定的層的分離層系統(tǒng)，用于將樣本位于其中的介質(zhì)與照 明物鏡和檢測物鏡空間分離。在此，該分離層系統(tǒng)以平行于參照面的邊界面至少在對于照 明物鏡和檢測物鏡為照明樣本和檢測來自樣本的光而可到達(dá)的區(qū)域中與介質(zhì)接觸，完全地 或至少幾乎完全地接觸。照明角度β和檢測角度S在此是借助檢測物鏡的數(shù)值孔徑nad和照明物鏡的nab預(yù)先給定的。該預(yù)先給定在此在如下意義下進行，即，部件相對于彼此布 置為使得在無需其它措施的條件下將所存在的像差最小化。當(dāng)然，若容忍較大的像差還可 以設(shè)置其它角度，而成像質(zhì)量將下降。
[0011] 在最簡單的情況下，分離層系統(tǒng)還可以僅由唯一的層構(gòu)成，則該層也可是空氣層， 其中，照明物鏡和檢測物鏡構(gòu)建為干燥物鏡。然而分離層系統(tǒng)還可以包括多個層，例如玻璃 或塑料層，其作為薄膜或板將樣本容器相對于兩個物鏡遮蓋。在該玻璃或塑料層與物鏡之 間于是存在空氣層或者具有浸沒液體的層，兩個物鏡與其接觸。然而分離層系統(tǒng)還可以由 唯一的流體層構(gòu)成，只要確保了該流體層不與樣本位于其中的介質(zhì)混合。該流體于是同樣 可以用作浸沒介質(zhì)。
[0012] 通過引入分離層系統(tǒng)，雖然可以有效地避免污染，但是由于照明和檢測光是穿過 分離層系統(tǒng)的邊界面到達(dá)樣本位于其中的介質(zhì)的，所以在為0. 3的低數(shù)值孔徑的情況下就 會出現(xiàn)極端的成像誤差如球面像差和慧差（Koma)。通過傾斜地穿過，增加了另外的不對稱 像差，或者其它像差增強。為了將這些像差最小化，因此借助檢測物鏡或照明物鏡的數(shù)值 孔徑NAD、NAB預(yù)先給定照明角度β和檢測角度δ。在此，以比檢測物鏡更大的角度布置具 有較低數(shù)值孔徑的、通常為照明物鏡的物鏡。檢測物鏡很少會有比照明物鏡更大的數(shù)值孔 徑。也常使用對稱的配置，其中將照明物鏡和檢測物鏡相同地構(gòu)造并且兩個物鏡與法線圍 成相同的角度。理想的是，照明角度β和檢測角度S之和總為90°。如果與此不同，例如 兩個物鏡可能以更小的角度布置，則該和小于90°，于是由于物面相對于檢測物鏡的光學(xué) 軸線傾斜而必須注意滿足Scheimpflug條件，即相機的圖像傳感器于是同樣必須相應(yīng)地傾 斜。也可以考慮其中如開頭提到的雙物鏡那樣將照明和檢測物鏡綜合在一個光學(xué)模塊中的 布置。
[0013] 如果該類型的、可以用標(biāo)準(zhǔn)物鏡進行的將像差簡單地最小化顯得不足夠，則其他 進一步降低或完全排除像差的措施也是可能的。
[0014] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選構(gòu)型中，因此照明光學(xué)系統(tǒng)和/或檢測光學(xué)系統(tǒng)包括用于將 像差、特別是由于照明光和/或待測光傾斜穿過分離層系統(tǒng)的邊界面而形成的像差