用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備的制造方法
【專利說明】用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備。這種設(shè)備包括用于容納位于介質(zhì)中的 樣本的樣本容器，其中，樣本容器相對于平面形的、通常水平的參照面被定向。該設(shè)備還包 括具有照明物鏡的照明光學(xué)系統(tǒng)，用于以光片照明樣本，其中，照明物鏡的光學(xué)軸線與光片 位于這樣的平面中，該平面與參照面的法線圍成不等于〇的照明角度β。最后，該用于光片 顯微技術(shù)的設(shè)備還包括具有檢測物鏡的檢測光學(xué)系統(tǒng)，檢測物鏡的光學(xué)軸線與參照面的法 線圍成不等于〇的檢測角度S。照明物鏡和檢測物鏡在此也可以構(gòu)建為所謂的雙物鏡，如 例如在ΕΡ0 866 993Β1中所描述的那樣。兩個(gè)物鏡于是綜合在共同的結(jié)構(gòu)單元中，于是， 各個(gè)光學(xué)系統(tǒng)，即物鏡及其所屬的光路和位于其中的光學(xué)元件，共享一些元件。
[0002] 這種設(shè)備尤其在檢查生物樣本時(shí)使用，在該檢查中，以光片照明樣本，光片的平面 與檢測的光軸線以不等于0的角度相交。通常在此，光片與通常為檢測物鏡的光軸線的檢 測方向圍成直角。借助該也稱作SPIM(SelectivePlaneIlluminationMicroscopy選擇 性平面照明顯微鏡）的技術(shù)可以在較短時(shí)間中也建立較厚樣本的空間記錄?；诠鈱W(xué)剖切 結(jié)合在垂直于剖面的方向上的相對運(yùn)動，可以以圖像方式、空間延展地示出樣本。
[0003] SP頂技術(shù)優(yōu)選用于熒光顯微鏡，在那里該技術(shù)也稱作LSFM(LightSheet FluorescenceMicroscopy光片焚光顯微鏡）。相對于諸如共焦激光掃描顯微鏡或二光子 顯微鏡的其它已知方法而言，LSFM技術(shù)具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：因?yàn)闄z測可以在寬視場中進(jìn)行，所 以可以采集更大的樣本區(qū)域。雖然分辨率比共焦激光掃描顯微鏡小一些，但是用LSFM技術(shù) 還可以分析更厚的樣本，因?yàn)檫M(jìn)入深度更大。此外，在該方法中，樣本的光負(fù)荷是最小的，這 尤其降低了使樣本褪色的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)闃颖緝H通過與檢測方向成不為〇的角度的薄光片被照 射。
[0004] 在此，不僅能使用例如借助圓柱透鏡產(chǎn)生的純靜態(tài)光片，還能使用準(zhǔn)靜態(tài)光片。該 準(zhǔn)靜態(tài)光片可以通過用于光束迅速掃描樣本的方式來產(chǎn)生。通過使光束經(jīng)歷相對于待觀察 樣本的極為快速的相對運(yùn)動以及在此時(shí)間上相繼地多次連續(xù)進(jìn)行，形成了光片狀的照明。 在此，將其上的傳感器最終成像樣本的相機(jī)的積分時(shí)間（Integrationszeit)選擇為使得 掃描在積分之間內(nèi)完成。替代具有2D陣列的相機(jī)，還可以使用結(jié)合檢測光學(xué)系統(tǒng)中的重新 掃描（Rescan)的陣列傳感器。該檢測還可以共焦地進(jìn)行。
[0005] SP頂技術(shù)如今在文獻(xiàn)中被多次描述，例如在DE10257423A1和基于其的TO 2004/053558A1 中或者在概覽性文章"SelectivePlaneIlluminationMicroscopy TechniquesinDevelopmentalBiology發(fā)育生物學(xué)中的選擇性平面照明顯微鏡技術(shù)"， J.Huisken等著，發(fā)表于 2009 年，雜志Development，136 卷，1963 頁中。
[0006] 光片顯微鏡的主要應(yīng)用之一在于成像平均尺寸的、大小為100 ym至數(shù)毫米的有 機(jī)體。通常，這些有機(jī)體嵌入在瓊脂糖凝膠中，其又位于玻璃毛細(xì)管中。玻璃毛細(xì)管被從上 方或下方引入到裝有水的樣本室中，并且將樣本從毛細(xì)管中擠出一段。用光片照明瓊脂糖 中的樣本，并且用垂直于光片和由此也垂直于光片光學(xué)系統(tǒng)的檢測物鏡將熒光在照相上成 像。
[0007] 光片顯微鏡的該方法具有三大缺點(diǎn)。首先，待檢查的樣本比較大，它源自發(fā)育生物 學(xué)。此外，由于樣本準(zhǔn)備和樣本室的尺寸，光片較厚并且由此限制了可達(dá)到的軸向分辨率。 再者，樣本準(zhǔn)備是麻煩的，與在熒光顯微鏡用于檢查單個(gè)細(xì)胞時(shí)常用的標(biāo)準(zhǔn)樣本準(zhǔn)備和標(biāo) 準(zhǔn)樣本保持也不兼容。
[0008] 為了能夠至少部分地避開這些限制，近年來發(fā)展了SP頂結(jié)構(gòu)，其中照明物鏡和檢 測物鏡相互垂直，并且分別以45°的角度從上方指向樣本。如果例如將樣本保持部位于其 上的桌面或者另一水平面看做參照面，則照明角度β和檢測角度δ分別為45°。這種結(jié) 構(gòu)例如在W0 2012/110488Α2 和在W0 2012/122027Α2 中被描述。
[0009] 樣本在這種結(jié)構(gòu)中例如位于皮氏培養(yǎng)皿的底板上。該皮氏培養(yǎng)皿裝有水，照明物 鏡和檢測物鏡浸泡在該液體中，水也承擔(dān)了浸沒液體的功能。該方法提供了在軸向上較高 分辨率的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榭梢援a(chǎn)生更薄的光片。由于該更高的分辨率，于是可以檢查更小的樣 本。樣本準(zhǔn)備也變得簡單很多。然而，一個(gè)大不利在于樣本準(zhǔn)備和樣本保持還是不符合所 提及的標(biāo)準(zhǔn)。于是皮氏培養(yǎng)皿必須較大，以便將兩個(gè)物鏡都浸泡在該培養(yǎng)皿中，而不碰到培 養(yǎng)皿的邊緣。微量滴定板，也稱作多孔板是在生物學(xué)很多領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)并且恰也在對單個(gè) 細(xì)胞的熒光顯微學(xué)分析中使用，微量滴定板在所述方法中無法使用，因?yàn)槲镧R不能以被浸 到格柵狀布置在板上的很小的凹處中。另一缺點(diǎn)在于，用該構(gòu)造難以短時(shí)內(nèi)分析多個(gè)樣本 (高通量篩選技術(shù)），因?yàn)槲镧R在樣本變更時(shí)必須被清潔，以避免不同樣本間的污染。
[0010] 本發(fā)明的任務(wù)在于改進(jìn)開頭所述類型的用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備，使得尤其簡化 以高通量分析樣本，方法是，簡化可以容納多個(gè)樣本的微量滴定板、即樣本保持部的使用。 [0011] 該任務(wù)在開頭描述類型的用于光片顯微技術(shù)的設(shè)備中這樣解決，即，在蓋部上構(gòu) 建有至少一個(gè)至少部分對于照明和檢測光透明的拱曲部用于容納樣本，其中，該拱曲部具 有內(nèi)邊界面和外邊界面。以該方式，明顯簡化了物鏡對樣本的到達(dá)，尤其可以使用微量滴定 板和可旋轉(zhuǎn)的微量滴定板，與樣本位于容器底板上和尤其將直立的顯微鏡配置用于分析的 情況相比，微量滴定板的凹處可以以較小的橫向尺寸來配置。
[0012] 在此重要的是，拱曲部的形狀、其在觀察中的位置以及照明和檢測物鏡的光學(xué)軸 線的位置相互協(xié)調(diào)，以便避免或最小化像差，該像差例如與光路對邊界面的傾斜穿過和由 此樣本容器的傾斜光入射和光出射相關(guān)聯(lián)。該協(xié)調(diào)以如下方式進(jìn)行，即，照明和檢測物鏡的 光學(xué)軸線與內(nèi)邊界面和外邊界面的法線至少在光學(xué)軸線穿過邊界面的區(qū)域中圍成最小角 度，即為〇或者很小，例如至多5度的角度。如果光學(xué)軸線和邊界面相互垂直，則僅出現(xiàn)球 面像差，其如在已知的、適配于頂板玻璃的顯微鏡物鏡中可以被校正。
[0013] 拱曲部的形狀在此是任意的，只要遵守所提及的條件。拱曲部例如可以取半圓桶 或半球形的形狀，其中，于是在協(xié)調(diào)過的最佳配置的設(shè)備中，兩個(gè)物鏡的光學(xué)軸線與半圓桶 的表面上的切線的法線相重合。
[0014] 在一個(gè)特別優(yōu)選的構(gòu)型中，至少一個(gè)拱曲部具有兩個(gè)從蓋部和樣本容器突出的、 具有平行的邊界面的板狀元件，它們在拱曲部的與樣本容器的其余部分距離最大處（在構(gòu) 建為凹槽的拱曲部中為凹槽的最低處，在構(gòu)建為突起部的拱曲部中為突起部的最高處）在 至少一個(gè)點(diǎn)上接觸，在該點(diǎn)上，凹槽或者突起部或者說樣本容器或容器頂板向下或向上封 閉。第一板狀元件的邊界面的法線在此在照明物鏡的光學(xué)軸線穿過的區(qū)域中與該光學(xué)軸線 重合，使得該法線和該光學(xué)軸線在該板狀元件的邊界面的任何位置上都平行于照明物鏡的 光學(xué)軸線。相應(yīng)地，第二板狀元件的邊界面的法線與檢測物鏡的光學(xué)軸線重合，于是在第二 板狀元件的邊界面的任何位置上都平行于該光學(xué)軸線。這在拱曲部相對于兩個(gè)物鏡的位置 方面進(jìn)行的協(xié)調(diào)中實(shí)現(xiàn)了較高的靈活性。意味著內(nèi)邊界面和外邊界面的相互平行層的平臺 卻不是必要的，尤其在兩個(gè)板狀元件接觸的區(qū)域中不是必要的，該區(qū)域可以設(shè)在具有小曲 率的內(nèi)側(cè)上，從而例如在凹槽的情況下一方面在凹槽最低點(diǎn)上將凹槽的強(qiáng)度增大并且另一 方面還阻止了污染物的頑固附著，如在兩個(gè)以某角度相碰的平面形板材，即在具有至少部 分V型橫截面的凹槽中那