本發(fā)明涉及一種多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花、其制備方法及應(yīng)用，例如制備基于免疫試紙條的高靈敏檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，屬于材料科學(xué)及分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

作為納米顆粒體系中極其重要的一員，納米金顆粒本身還具有獨(dú)特的物理化學(xué)性能，如良好的生物相容性，使納米金顆粒在生物標(biāo)記和生物傳感方面得到廣泛應(yīng)用。目前納米金的制備方法主要有：液相還原法、光化學(xué)法、氣相蒸發(fā)法、種晶生長(zhǎng)法、電化學(xué)還原法、相轉(zhuǎn)移法、水熱法、微波法等。但此類方法大多只能用于合成球形納米金顆粒，而不適于制備具有特殊形貌，例如具有花球狀結(jié)構(gòu)的納米金顆粒等。因而，為制備這些具有特殊形貌的納米金顆粒，一般需要另行設(shè)計(jì)特殊的制備方法，但現(xiàn)有的此類方法大多存在工藝復(fù)雜，可控性差，成品率低等不足。另一方面，免疫層析檢測(cè)結(jié)合了色譜分析和免疫反應(yīng)的特征，具有快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)分析的有點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速初級(jí)檢測(cè)。免疫層析檢測(cè)中應(yīng)用最為普遍的一類是膠體金標(biāo)記側(cè)向試紙條(簡(jiǎn)稱金標(biāo)試紙條)，典型的金標(biāo)試紙條包括PVC膠板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊。當(dāng)樣品溶液流經(jīng)試紙條，溶液中待檢測(cè)物與結(jié)合釋放墊上的金標(biāo)抗體結(jié)合后一起流動(dòng)到檢測(cè)T線固定聚集，通過(guò)讀取儀檢測(cè)T線金標(biāo)抗體聚集體的光散射強(qiáng)度，定性檢測(cè)目標(biāo)分子。結(jié)合墊中的膠體金起到識(shí)別、富集目標(biāo)檢測(cè)物和提供光學(xué)檢測(cè)信號(hào)的重要作用，是決定試紙條靈敏度的關(guān)鍵材料之一。常規(guī)膠體金試紙條使用納米金球其光學(xué)信號(hào)有限，靈敏度不高，因而限制了其實(shí)際應(yīng)用。

多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花顆粒具有納米級(jí)粗糙表面和更大的比表面積，可以結(jié)合更多的抗體，更容易捕獲目標(biāo)檢測(cè)物，從而提高試紙條檢測(cè)靈敏度。目前已有方法制備的納米金花比表面積相對(duì)較小，多級(jí)結(jié)構(gòu)不明顯，合成步驟較多，可重復(fù)性差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種簡(jiǎn)便、高產(chǎn)率制備所述多級(jí)納米金花的方法。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述多極納米金花的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

一種多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花的制備方法，其包括：

將氯金酸與作為穩(wěn)定劑的陽(yáng)離子聚電解質(zhì)在水相體系中充分混合，并在溫度為20℃～40℃的條件下持續(xù)攪拌或振蕩，至形成的混合溶液呈現(xiàn)黃色，

向獲得的黃色混合溶液內(nèi)加入還原劑，并劇烈攪拌或振蕩10s以上，優(yōu)選為10s～60s，再加入作為種子的納米金球，之后將形成的混合反應(yīng)體系快速攪拌或振蕩10s以上，優(yōu)選為10s～30s，而后在室溫靜置2h以上，優(yōu)選為2h～4h。

進(jìn)一步的，所述還原劑包括抗壞血酸或硼氫化鈉等，優(yōu)選為抗壞血酸，但不限于此。

進(jìn)一步的，所述聚電解質(zhì)包括聚二烯丙基二甲基氯化銨或殼聚糖季銨鹽等，優(yōu)選為聚二烯丙基二甲基氯化銨，但不限于此。

在一實(shí)施方案之中，所述制備方法包括：采用檸檬酸鈉還原氯金酸制得所述納米金球。

在一較佳實(shí)施方案之中，所述制備方法包括：在所述混合反應(yīng)體系中，穩(wěn)定劑的濃度為1.8％～35wt％，氯金酸的濃度為1mmol/L～20mmol/L，還原劑的濃度為5mmol/L～0.1mmol/L，種子的濃度為2.5×10^-4mmol/L～2.5×10^-2mmol/L。

其中，所述納米金球的粒徑優(yōu)選為10nm～30nm。

所述多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花的粒徑為50nm～300nm，并且所述納米金花表面具有長(zhǎng)約40nm～80nm、寬約10nm～40nm的花瓣型尖端凸起，大幅增加了納米金花的比表面積和表面粗糙度。

一種金標(biāo)抗體，其包含所述的多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花以及結(jié)合在所述納米金花上的選定抗體。

所述金標(biāo)抗體的制備方法包括：將所述的多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花與選定抗體于pH值為7～10的液相體系中充分混合，并以BSA或者酪蛋白封閉，再除去未標(biāo)記的選定抗體。

一種試劑盒，其包括：

免疫層析試紙條，其檢測(cè)墊上分布有彼此不重合的檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線和質(zhì)控線分別包含有第一抗體和第二抗體；

以及所述的金標(biāo)抗體，其中所述選定抗體采用第三抗體；

其中，所述第一抗體僅在有目標(biāo)物存在的情況下才能與目標(biāo)物及第三抗體特異性結(jié)合，而所述第二抗體無(wú)論在有或無(wú)目標(biāo)物存在的情況下均能與第三抗體特異性結(jié)合。

作為較佳實(shí)施方案之一，所述試劑盒一種大腸桿菌檢測(cè)試劑盒。

一種檢測(cè)方法，其包括：

提供所述的試劑盒，

將液態(tài)的待檢樣品與所述金標(biāo)抗體混合后，再施加至所述試紙條的加樣孔中，

以及，以裸眼判讀和/或試紙條讀取儀檢測(cè)作為檢測(cè)手段，對(duì)樣品內(nèi)的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量判斷。

進(jìn)一步的，所述的檢測(cè)方法具體可以包括：將金標(biāo)抗體與液態(tài)的待檢樣品充分混合后，再滴加到試紙條的加樣孔中，經(jīng)設(shè)定時(shí)間后，以試紙條讀取儀檢測(cè)檢測(cè)線的光學(xué)強(qiáng)度變化，從而定性和/或定量檢測(cè)待檢樣品中目標(biāo)物的含量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果至少在于：

(1)提供了一種新型的多級(jí)結(jié)構(gòu)的納米金花，其具有納米級(jí)粗糙表面和更大的比表面積，在應(yīng)用為試紙條的標(biāo)記抗體時(shí)可以結(jié)合更多的抗體，更容易捕獲目標(biāo)檢測(cè)物，從而可大幅提高檢測(cè)靈敏度；

(2)提供了一種一步法制備多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花的新方法，其操作簡(jiǎn)便、，納米金花產(chǎn)率較高，可重復(fù)性好；

(3)提供了一種基于所述多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，其能顯著改善常規(guī)試紙條的檢測(cè)效果，例如，當(dāng)應(yīng)用于檢測(cè)大腸桿菌時(shí)，檢測(cè)限可降低到10³CFU/mL，靈敏度有顯著提升。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明一典型實(shí)施方案之中制備的多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花粒子的掃描電鏡圖；

圖2a-圖2b是本發(fā)明一典型實(shí)施方案之中納米金花表面修飾抗體用于試紙條檢測(cè)大腸桿菌的示意圖；

圖3是本發(fā)明一典型實(shí)施方案之中多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花標(biāo)記抗體檢測(cè)不同濃度大腸桿菌的試紙條照片；

圖4是本發(fā)明一典型實(shí)施方案之中納米金花標(biāo)記抗體檢測(cè)不同濃度大腸桿菌的檢測(cè)線光強(qiáng)度圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花粒子(如下簡(jiǎn)稱“多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花”或“納米金花”)的制備工藝，其主要是以聚電解質(zhì)作為穩(wěn)定劑，利用高分子鏈段的多級(jí)構(gòu)象，使得金納米粒子在多個(gè)成核中心同時(shí)生長(zhǎng)，從而有效制得多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花，該納米金花粒子表面具有納米級(jí)的尖端凸起，即表面具有納米級(jí)的粗糙形貌，因而具有更大比表面積。

在一較為典型的實(shí)施例之中，一種納米金花的制備方法可以包括如下步驟：

1)檸檬酸鈉還原氯金酸制備粒徑為10nm～30nm的納米金球粒子，將其作為制備納米金花粒子的種子。

2)將氯金酸加入聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)水溶液中，25℃下攪拌15分鐘以上，至溶液呈現(xiàn)黃色，然后將抗壞血酸水溶液快速加入上述黃色溶液中，劇烈攪拌30秒以上，加入前述的納米金球種子，快速攪拌10秒以上，室溫下靜置4小時(shí)以上。

本發(fā)明的另一方面提供了所述多級(jí)納米金花粒子的用途。例如，將其作為免疫層析試紙條的金標(biāo)抗體，而應(yīng)用于生物、化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。

進(jìn)一步的，作為其中的典型應(yīng)用方案之一，可以在所述納米金花上連接特定的抗體而形成金標(biāo)抗體，并與試紙條，例如免疫層析試紙條而組合形成試劑盒，用于檢測(cè)目標(biāo)物。

其中，抗體，例如大腸桿菌的特異性單抗可以借助靜電作用力而修飾于納米金花粒子表面。其中，利用納米金花粒子的多級(jí)結(jié)構(gòu)和納米級(jí)表面凸起，可以修飾更多的抗體，更容易捕獲、富集目標(biāo)物，例如大腸桿菌細(xì)胞，從而提高試紙條檢測(cè)目標(biāo)物的靈敏度。

在本發(fā)明中所采用的試紙條可以包括依次設(shè)置的過(guò)濾墊、樣本墊和檢測(cè)墊，所述樣本墊的邊緣部與過(guò)濾墊及檢測(cè)墊相互接觸或重合，所述檢測(cè)墊上分布有彼此不重合的檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線和質(zhì)控線可分別包含有所述的第一抗體和第二抗體。

進(jìn)一步，本發(fā)明的試劑盒在應(yīng)用時(shí)，其中目標(biāo)物與所述金標(biāo)抗體以及檢測(cè)線上對(duì)應(yīng)的第一抗體是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合的原理呈夾心模式結(jié)合，因而，所述試劑盒對(duì)于某些生物、化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)都是適用的，特別適合于以雙抗夾心模式檢測(cè)的大分子蛋白質(zhì)、細(xì)胞等物質(zhì)。

進(jìn)一步，所述試紙條還可包括依次分布的過(guò)濾墊、樣本墊、檢測(cè)墊和吸水墊，所述檢測(cè)墊與吸水墊的邊緣部相互接觸或重合。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的，在前述試紙條中，各組成部分的功能大致如下：

過(guò)濾墊，主要用于初步過(guò)濾樣品基質(zhì)；

樣本墊，樣本墊經(jīng)特定處理液處理，具有一定的pH緩沖作用，用于調(diào)節(jié)待檢物的pH以及 協(xié)助待檢物和金標(biāo)抗體在試紙條上的流動(dòng)；

檢測(cè)墊，檢測(cè)墊表面分布有彼此不重合的檢測(cè)線和質(zhì)控線。

進(jìn)一步的，所述試紙條還可包括：吸水紙，用于吸收多余的金標(biāo)抗體金以及未參加反應(yīng)的液體樣品等。

進(jìn)一步的，所述過(guò)濾墊可采用聚酯膜，檢測(cè)墊采用硝酸纖維膜，但均不限于此。

在一實(shí)施例中，可以將聚酯墊、樣本墊、檢測(cè)墊、吸水紙依次重疊組裝成所述試紙條。

本發(fā)明的又一個(gè)方面提供了一種檢測(cè)系統(tǒng)，包括：

所述的試劑盒，

以及，檢測(cè)設(shè)備，用以監(jiān)測(cè)在所述試紙條上施加待檢樣品與金標(biāo)抗體的混合物前后，于所述試紙條的質(zhì)控線和檢測(cè)線處的信號(hào)變化情況，特別是光學(xué)信號(hào)變化情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣品中目標(biāo)物的定性和/或定量判斷。

進(jìn)一步的，所述檢測(cè)設(shè)備包括試紙條讀取儀。

本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了一種檢測(cè)方法，其包括：

提供所述的試劑盒，

將液態(tài)的待檢樣品與所述金標(biāo)抗體混合后，再施加至所述試紙條上，

以及，以裸眼判讀和/或試紙條讀取儀檢測(cè)作為檢測(cè)手段，對(duì)樣品內(nèi)的目標(biāo)物進(jìn)行定性和/或定量判斷。

進(jìn)一步的，所述的檢測(cè)方法具體可包括：

將金標(biāo)抗體與液態(tài)的待檢樣品充分混合后，再滴加到試紙條的樣本墊上，經(jīng)設(shè)定時(shí)間后，通過(guò)裸眼觀察試紙條上檢測(cè)線和質(zhì)控線的顏色變化，定性分析待檢樣品中是否存在目標(biāo)物，或者以試紙條讀取儀記錄T、C值和T/C值，并與預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，從而定量檢測(cè)待檢樣品中目標(biāo)物的含量。

進(jìn)一步的，前述標(biāo)準(zhǔn)曲線可通過(guò)業(yè)界悉知的方式建立，例如，可以通過(guò)下列方法獲得，即：制備一系列不同濃度的目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)樣品，依照前述檢測(cè)方法，分別獲得和記錄與不同濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)的T、C值和T/C值，并探知檢測(cè)結(jié)果與樣品濃度存在的數(shù)學(xué)關(guān)系，從而建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

其中，T、C值分別為試紙條讀取儀測(cè)得的檢測(cè)線(T線)和和質(zhì)控線(C線)的檢測(cè)值，例如吸光度值等，這應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)常識(shí)及本說(shuō)明書(shū)可很容易且明確的知悉的。

即以檢測(cè)大腸桿菌為例，本發(fā)明中，可以在所述納米金花表面修飾大腸桿菌特異性抗體， 再用于試紙條高靈敏檢測(cè)大腸桿菌。

在一較為典型的實(shí)施例之中，一種多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花標(biāo)記抗體用于免疫層析試紙條高靈敏檢測(cè)大腸桿菌的方法可以包括：

1)納米金花的表面修飾過(guò)程。請(qǐng)參閱圖2a，可以將納米金花水溶液室溫下攪拌10分鐘，用碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)納米金花粒子溶液pH≈8，攪拌10分鐘。將大腸桿菌單抗(murine anti-E.coli O157:H7mAb)水溶液加入納米金花水溶液，室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后加入封閉劑牛血清蛋白水溶液，室溫?cái)嚢?0分鐘。將標(biāo)記號(hào)的好的納米金花抗體離心分離，重新分散在磷酸鹽緩沖液中備用。

2)待檢樣本的提取。將食品待檢測(cè)樣本粉碎，分散在水溶液中，過(guò)濾后收集濾液，離心濃縮分散在磷酸鹽緩沖液中備用。

3)將納米金花標(biāo)記抗體與待檢測(cè)濃縮溶液在Elisa酶標(biāo)板中混合，靜置3分鐘。然后將上述混合溶液直接滴入免疫層析試紙條的加樣孔中，靜置10分鐘后，用試紙條讀取儀檢測(cè)試紙條檢測(cè)線(T線)的光學(xué)強(qiáng)度，以獲得檢測(cè)大腸桿菌的結(jié)果。

顯然的，在該典型實(shí)施例采用的試紙條中，亦包含檢測(cè)線和質(zhì)控線，其中檢測(cè)線和質(zhì)控線中可分別包含由大腸桿菌免疫獲得的多抗和能與所有單抗特異性結(jié)合的二抗等，其結(jié)構(gòu)和工作原理等可參閱圖2b。

以下進(jìn)一步結(jié)合一更為具體的實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作更為詳細(xì)的解釋說(shuō)明。

實(shí)施例1：

(1)制備多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花顆粒：納米金花的合成是根據(jù)納米晶種的再生長(zhǎng)法，主要有如下步驟：

第一，金納米晶種的合成：將100毫升、2.5×10^-4摩爾/升的氯金酸水溶液加熱到120^℃，加入10毫升、1％的檸檬酸鈉水溶液，攪拌30分鐘后，溶液變?yōu)榫萍t色，停止加熱冷卻到室溫，備用。

第二，多級(jí)結(jié)構(gòu)納米金花生長(zhǎng)液的配置：取0.4毫升、24毫摩爾/升的氯金酸水溶液加入35％的聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)水溶液中，室溫?cái)嚢?5分鐘。然后加入0.8毫升、0.1摩爾/升的抗壞血酸水溶液，攪拌30秒，至溶液變成無(wú)色通明。

第三，納米晶種生長(zhǎng)成納米金花：0.1毫升的納米晶種溶液快速滴加上述第二步配置的生長(zhǎng)液中，攪拌均勻，靜置6小時(shí)，至溶液變成橙色，表明生成了納米金花，其尺寸和形貌可 參閱圖1。

其中，通過(guò)調(diào)控PDDA和氯金酸水溶液濃度可以控制納米金花的形貌，而納米金花的微觀形貌可通過(guò)掃描電鏡等檢測(cè)。

(2)納米金花標(biāo)記抗體的制備：

將2毫升前述步驟三獲得的納米金花水溶液攪拌10分鐘，加入碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值>8，攪拌穩(wěn)定10分鐘。再加入0.5毫升、4.5微克/毫升大腸桿菌單抗水溶液，攪拌1小時(shí)。之后加入0.4毫升、5％的牛血清蛋白，攪拌30分鐘。最后，將標(biāo)記后的納米金花粒子(即金標(biāo)抗體)離心分離，重新分散在0.4毫升磷酸鹽緩沖液(pH≈7.4)中，備用。

(3)金標(biāo)抗體用于試紙條檢測(cè)大腸桿菌：

將金標(biāo)抗體與不同濃度(0、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷CFU/mL)的大腸桿菌樣品溶液混合，靜置3分鐘。參閱圖3，隨后直接轉(zhuǎn)移到常規(guī)免疫試紙條的加樣孔中，10分鐘后檢測(cè)樣品溶液全部流過(guò)試紙條，用試紙條讀取儀測(cè)試檢測(cè)線處納米金花聚集體的光散射強(qiáng)度。參閱圖4，可以看到，利用該金標(biāo)抗體，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)濃度下限達(dá)到10³CFU/mL。

采用本發(fā)明的技術(shù)方案，可以制備新型免疫層析試紙條，用于食品安全、環(huán)境、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域的簡(jiǎn)便、高靈敏分析檢測(cè)。

應(yīng)當(dāng)指出，以上所述本發(fā)明的具體實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所作出的各種其他相應(yīng)的改變與變形，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。