本發(fā)明涉及質(zhì)譜檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種貴金屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子及其在基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜分析中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自20世紀80年代發(fā)明基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI MS)以來，作為一種質(zhì)譜技術(shù)作為一種新興的軟電離方法，該技術(shù)成功解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性的生物大分子難以電離問題。由于其靈敏度高、操作簡單方便，MALDI MS已廣泛應(yīng)用于生物大分子特別是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域，其可在10^-12mol甚至10^-15mol的水平上準確地測定分子量高達幾萬到幾十萬的生物大分子，還可通過改變基質(zhì)、溶液條件和樣品的制備方法等實現(xiàn)大分子蛋白質(zhì)非共價復(fù)合物的質(zhì)譜檢測。

然而，由于基質(zhì)峰的干擾，這種技術(shù)目前只能用于大分子量(>1000Da)樣品的分析，應(yīng)用領(lǐng)域尚未廣泛擴展到小分子量(<500Da)樣品的研究。為能夠?qū)崿F(xiàn)MALDI在低分子量端的應(yīng)用，找到一種合適的基質(zhì)用以排除基質(zhì)干擾，同時提高MALDI的離子化效率來提升質(zhì)譜檢測的靈敏度成為當前研究的熱點。1988年，Tanaka等首次將納米材料作為基質(zhì)引入到MALDI MS分析中，成功應(yīng)用30nm無機鈷納米顆粒和甘油混合分析了蛋白質(zhì)溶菌酶。隨后，以多孔硅、碳納米管、硅納米粒子、金納米粒子等作為基質(zhì)的研究也取得一定效果。此外，在對于復(fù)雜生物樣品體系檢測中，由于大量蛋白質(zhì)、鹽類等物質(zhì)存在，待測樣品離子化效率被嚴重干擾，從而檢出效率低下。

因此，開發(fā)一種全新的基質(zhì)用于實際生物樣品中小分子端物質(zhì)的檢測對解決疾病篩查等問題有重大意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種貴金屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子及其制備與應(yīng)用，具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種貴金屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子，該納米粒子具有雙層結(jié)構(gòu)，以二氧化硅納米粒子為核，以銀納米粒子連續(xù)包覆形成殼層結(jié)構(gòu)；該納米粒子為球形顆粒，粒徑不大于1μm，顆粒粒度均一。

進一步地，該納米粒子的粒徑范圍為100nm～300nm。

進一步地，該納米粒子的殼層結(jié)構(gòu)的厚度可調(diào)節(jié)，范圍在3～80nm，并且該調(diào)節(jié)是可根據(jù)銀氨溶液用量調(diào)控的。

進一步地，上述殼層結(jié)構(gòu)由粒徑范圍為5～10nm的銀納米粒子構(gòu)成，更進一步地，其粒徑范圍為5nm～8nm。

本發(fā)明還提供了一種貴金屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、以硝酸銀為前驅(qū)體，制備不同濃度的銀氨溶液；

步驟2、將二氧化硅加入步驟1中得到的銀氨溶液，并在室溫下超聲至溶液呈均相分散；

步驟3、將聚乙烯呲咯烷酮加入步驟2中得到的混合溶液，于30～100℃下反應(yīng)0.5～10小時，以形成不同厚度的核殼結(jié)構(gòu)；

步驟4、用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌步驟3中得到的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子，于60～70℃下干燥成粉末狀，即得到硅核銀殼的納米粒子。

本發(fā)明還提供了一種貴金屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子作為基質(zhì)在質(zhì)譜分析中的應(yīng)用，包括以下步驟：

步驟1、儀器與試劑的準備：激光解析電離質(zhì)譜儀，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析；采用脈沖電場延時提取及反射的工作方式，正離子模式進行檢測；

步驟2、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法制備硅核銀殼的納米粒子；

步驟3、將步驟2中得到的納米粒子重懸于去離子水中，作為質(zhì)譜基質(zhì)待用；

步驟4、制備質(zhì)譜待測樣品；

步驟5、將硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)與待測樣品在靶板上復(fù)合點樣，用于質(zhì)譜分析；

步驟6、利用內(nèi)標物質(zhì)進行質(zhì)譜定量分析。

進一步地，上述靶板必須為潔凈的靶板，依次用無水乙醇、去離子水超聲清洗共1小時。

進一步地，上述步驟5中，將硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)在去離子水中超聲振蕩分散，當硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)干燥后，在其表面滴加待測樣品，干燥，硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)與待測樣品形成二次重結(jié)晶；或者，將硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)在去離子水中超聲振蕩分散后與待測樣品混合均勻，干燥，硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)與待測樣品形成二次重結(jié)晶。

本發(fā)明還提供了一種貴金屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子作為基質(zhì)在生物樣品的質(zhì)譜分析中的應(yīng)用，生物樣品包括血清、腦脊液、尿液、乳液、淚液、汗液。

進一步地，質(zhì)譜分析定量的對象包括上述生物樣品中的小肽段、核苷酸單體、 氨基酸、糖類、脂類和藥物小分子中的一種或多種。

進一步地，激光解析電離質(zhì)譜儀為AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800質(zhì)譜儀，采用Nd:YAG激光器，波長為355nm。

進一步地，采用DataExplorer進行數(shù)據(jù)的分析處理。

利用上述硅核銀殼的納米粒子可進行生物體系中小分子的精準定量。根據(jù)體系中小分子質(zhì)譜峰和內(nèi)標物小分子同位素質(zhì)譜峰面積比，已知小分子同位素濃度，二者為線性關(guān)系，故可求得實際體系中小分子濃度。

上述貴金屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子作為基質(zhì)能夠?qū)ι矬w系中代謝小分子解析離子化效果選擇性地增強?？捎糜趯嶋H生物樣品體系中分子量為100Da～10000Da的分子檢測，包括血清、腦脊液、尿液、乳液、淚液、汗液等體系中小肽段、核苷酸單體、氨基酸、糖類、脂類或藥物小分子等。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

靈敏度提高：有效排除有機基質(zhì)的背景噪聲干擾，實現(xiàn)對小分子物質(zhì)的精準識別。

耐鹽性、耐蛋白性良好：有效去除復(fù)雜的體系中含量較高的鹽類、蛋白大分子等的影響。

樣本消耗量少：僅消耗納升數(shù)量級的待測樣本即可得到其分子指紋圖譜，傳統(tǒng)的生化檢測方法需2.5微升～40微升，而本發(fā)明能將樣品量降至納升級別。

操作簡便：實驗中無需對樣品進行任何預(yù)處理，操作便捷，提供了高效、簡便的檢測方法。

定量精準：量化結(jié)果與傳統(tǒng)的生化檢測方法即臨床金標的差別很小。

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明，以充分說明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和技術(shù)效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明較優(yōu)實施例中制備得到的不同殼層厚度的貴金屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的表征圖片，圖1a為0.24M銀氨溶液制備的納米粒子SEM圖片，圖片1b為0.3M銀氨溶液制備的納米粒子SEM圖片；圖片1c為0.5M銀氨溶液制備的納米粒子SEM圖片；

圖2是以本發(fā)明較優(yōu)實施例中制備得到的貴金屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子為基質(zhì)檢測小分子標準品得到的質(zhì)譜圖；圖2a是檢測葡萄糖標準品得到的質(zhì)譜圖(葡萄糖標準品峰203:[葡萄糖+Na]+,219:[葡萄糖+K]+)；圖2b是檢測精氨酸標準品得到的質(zhì)譜圖(精氨酸標準品峰197:[精氨酸+Na]+,213:[精氨酸+K]+)；

圖3是檢測腦脊液成分的質(zhì)譜圖：圖3a為不使用任何基質(zhì)的質(zhì)譜圖，圖3b為使用傳統(tǒng)基質(zhì)CHCA的質(zhì)譜圖，圖3c為以本發(fā)明較優(yōu)實施例中制備得到的貴金 屬核殼結(jié)構(gòu)納米粒子為基質(zhì)的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行進一步描述。

硅核銀殼的納米粒子的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、以硝酸銀為前驅(qū)體，逐滴滴加氨水至溶液中黃褐色沉淀完全消失，溶液澄清透明，后定容以制備10^-2M～1M銀氨溶液；

步驟2、將質(zhì)量分數(shù)2％～3％的二氧化硅分散液加入步驟1中得到的銀氨溶液，并在室溫下超聲至液體呈均勻分散；

步驟3、將聚乙烯呲咯烷酮加入步驟2中得到的混合溶液，于30～100℃下反應(yīng)0.5～10小時，以形成不同厚度的核殼結(jié)構(gòu)；

步驟4、用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌步驟3中得到的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子，于60～70℃下干燥成粉末狀，即得到硅核銀殼的納米粒子。

將上述步驟中得到的納米粒子重懸于去離子水中，作為質(zhì)譜基質(zhì)待用；

表征所用的儀器：

產(chǎn)物的尺寸和形貌表征在JEOL JEM-2100F透射電鏡TEM，JEOL JEM-2100F高分辨透射電鏡HRTEM以及Hitachi S-4800掃描電鏡SEM上完成。

表征結(jié)果為：

典型的硅核銀殼的納米粒子為納米球形顆粒，該納米球形顆粒的粒徑范圍為100nm～300nm，顆粒粒度均一，該納米球形顆粒具有核殼雙層結(jié)構(gòu)，表面由5～10nm的納米銀小球組成，SEM表征圖片如圖1a至1c所示。納米粒子的殼層結(jié)構(gòu)的厚度可調(diào)節(jié)，銀氨的用量越高，殼層的厚度越厚。

實施例1檢測葡萄糖標準品

利用硅核銀殼的納米粒子作為基質(zhì)對葡萄糖小分子標準品進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜檢測的步驟如下：

(1)儀器與試劑的準備：激光解析電離質(zhì)譜儀，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800質(zhì)譜儀，Nd:YAG激光器，波長為355nm。采用脈沖電場延時提取及反射的工作方式，正離子模式進行檢測。采用DataExplorer觀察、處理、分析數(shù)據(jù)，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。

(2)制備硅核銀殼的納米粒子。

(3)依次用無水乙醇、去離子水超聲清洗MALDI靶板共1小時。

(4)將硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)在去離子水中超聲振蕩分散，當硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)干燥后，在其表面滴加葡萄糖樣品，干燥，硅核銀殼的納米 粒子基質(zhì)與葡萄糖樣品形成二次重結(jié)晶，在干燥的MALDI靶板上點樣。

(5)干燥后，用于激光解析離子化質(zhì)譜分析。

質(zhì)譜結(jié)果示于圖2a。

實施例2檢測精氨酸標準品

利用硅核銀殼的納米粒子作為基質(zhì)對精氨酸小分子標準品進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜檢測的步驟如下：

(1)儀器與試劑的準備：激光解析電離質(zhì)譜儀，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800質(zhì)譜儀，Nd:YAG激光器，波長為355nm。采用脈沖電場延時提取及反射的工作方式，正離子模式進行檢測。采用DataExplorer觀察、處理、分析數(shù)據(jù)，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。

(2)制備硅核銀殼的納米粒子。

(3)依次用無水乙醇、去離子水超聲清洗MALDI靶板共1小時。

(4)將硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)在去離子水中超聲振蕩分散，當硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)干燥后，在其表面滴加精氨酸樣品，干燥，硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)與精氨酸樣品形成二次重結(jié)晶，在干燥的MALDI靶板上點樣。

(5)干燥后，用于激光解析離子化質(zhì)譜分析。

質(zhì)譜結(jié)果示于圖2b。

實施例3檢測纖維二糖標準品

利用硅核銀殼的納米粒子作為基質(zhì)對纖維二糖標準品進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜檢測的步驟如下：

(1)儀器與試劑的準備：激光解析電離質(zhì)譜儀，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800質(zhì)譜儀，Nd:YAG激光器，波長為355nm。采用脈沖電場延時提取及反射的工作方式，正離子模式進行檢測。采用DataExplorer觀察、處理、分析數(shù)據(jù)，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。

(2)制備硅核銀殼的納米粒子。

(3)依次用無水乙醇、去離子水超聲清洗MALDI靶板共1小時。

(4)將硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)在去離子水中超聲振蕩分散，當硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)干燥后，在其表面滴加纖維二糖標準品，干燥，硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)與纖維二糖標準品形成二次重結(jié)晶，在干燥的MALDI靶板上點樣。

(5)干燥后，用于激光解析離子化質(zhì)譜分析。

實施例4檢測谷氨酸標準品

利用硅核銀殼的納米粒子作為基質(zhì)對谷氨酸小分子標準品進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜檢測的步驟如下：

(1)儀器與試劑的準備：激光解析電離質(zhì)譜儀，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800質(zhì)譜儀，Nd:YAG激光器，波長為355nm。采用脈沖電場延時提取及反射的工作方式，正離子模式進行檢測。采用DataExplorer觀察、處理、分析數(shù)據(jù)，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。

(2)制備硅核銀殼的納米粒子。

(3)依次用無水乙醇、去離子水超聲清洗MALDI靶板共1小時。

(4)將硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)在去離子水中超聲振蕩分散，當硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)干燥后，在其表面滴加谷氨酸樣品，干燥，硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)與谷氨酸樣品形成二次重結(jié)晶，在干燥的MALDI靶板上點樣。

(5)干燥后，用于激光解析離子化質(zhì)譜分析。

實施例5檢測苯丙氨酸標準品

利用硅核銀殼的納米粒子作為基質(zhì)對谷氨酸小分子標準品進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜檢測的步驟如下：

(1)儀器與試劑的準備：激光解析電離質(zhì)譜儀，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800質(zhì)譜儀，Nd:YAG激光器，波長為355nm。采用脈沖電場延時提取及反射的工作方式，正離子模式進行檢測。采用DataExplorer觀察、處理、分析數(shù)據(jù)，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。

(2)制備硅核銀殼的納米粒子。

(3)依次用無水乙醇、去離子水超聲清洗MALDI靶板共1小時。

(4)將硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)在去離子水中超聲振蕩分散，當硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)干燥后，在其表面滴加苯丙氨酸樣品，干燥，硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)與苯丙氨酸樣品形成二次重結(jié)晶，在干燥的MALDI靶板上點樣。

(5)干燥后，用于激光解析離子化質(zhì)譜分析。

實施例6檢測腦脊液樣品

(1)儀器與試劑的準備：激光解析電離質(zhì)譜儀，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800質(zhì)譜儀，Nd:YAG激光器，波長為355nm。采用脈沖電場延時提取及反射的工作方式，正離子模式進行檢測。采用DataExplorer觀察、處理、分析數(shù)據(jù)，只有信噪比大于10的質(zhì)譜信號 用于分析。

(2)制備硅核銀殼的納米粒子。

(3)依次用無水乙醇、去離子水超聲清洗MALDI靶板共1小時。

(4)制備腦脊液樣品。此處的制備是常規(guī)的操作，不需要對樣品進行任何預(yù)處理。

(5)將硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)在去離子水中超聲振蕩分散后與腦脊液樣品混合均勻，干燥，硅核銀殼的納米粒子基質(zhì)與腦脊液樣品形成二次重結(jié)晶，在干燥的MALDI靶板上點樣。

(6)干燥后，用于激光解析離子化質(zhì)譜分析。

質(zhì)譜結(jié)果示于圖3c。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。