本發(fā)明涉及一種蛋白介導(dǎo)合成修飾鈰納米材料的方法，屬于表面修飾的功能納米材料制備技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)。是涉及一種利用血清蛋白類生物大分子在堿性條件下介導(dǎo)合成修飾鈰納米材料的新方法，特別涉及對(duì)鈰納米簇、鈰納米顆粒及鈰納米鏈的綠色可控合成修飾。

背景技術(shù)：

鈰納米材料由于其表面Ce³⁺/Ce⁴⁺共存從而賦予其優(yōu)異的氧化還原活性，使其在化學(xué)催化反應(yīng)，輻射防護(hù)，腫瘤放化療，抗氧化類疾病的治療及再生醫(yī)學(xué)方向都具有十分重要而廣闊的應(yīng)用前景(Nanoscale.2011，3，1411-1420、NPG Asia Mater.2014，6，e90、ACS Nano.2016，10，2860–2870、Chem.Rev.2016，DOI:10.1021/acs.chemrev.5b00603)。而隨著近年來(lái)鈰納米材料(主要是鈰納米顆粒)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的進(jìn)一步的深入推進(jìn)，對(duì)鈰納米材料本身的化學(xué)穩(wěn)定性、生物學(xué)活性及生物相容性要求亦是越發(fā)嚴(yán)格。一方面，雖然前期致力于鈰納米顆粒生物學(xué)效應(yīng)研究，也取得了相當(dāng)大的成果，但大部分研究是在未經(jīng)修飾、弱表面活性劑保護(hù)或有機(jī)高聚物修飾的鈰納米顆粒(Nano Lett.2005，5，2573-2577、Biomaterials.2007，28，1918-1925、Adv.Funct.Mate.2010，20，1617-162、Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，2308-2312、Biomaterials.2012，33，8771-8781、ACS Nano.2013，7，4855-4868)的情況下進(jìn)行的，故其材料本身的穩(wěn)定性，生物學(xué)活性及生物相容性都存在不同程度的問(wèn)題，在一定程度上影響了其研究分析的結(jié)果，從而限制了其在生物體內(nèi)的進(jìn)一步應(yīng)用研究；另一方面，由于前期鈰納米簇及鈰納米鏈的合成研究方法報(bào)道較少，近些年僅有極少數(shù)鈰納米簇在催化領(lǐng)域的研究報(bào)道(ACS Nano.2015，9，8617–8626、J.Phys.Chem.A.2016，120，2313–2319、Surface Science.2016，doi:10.1016/j.susc.2016.03.020)，而鈰納米簇及鈰納米鏈進(jìn)一步的表面修飾及生物學(xué)應(yīng)用更是未見(jiàn)報(bào)道。

因此，如何有效地解決鈰納米材料本身的化學(xué)穩(wěn)定性，保證其生物學(xué)活性及提高其生物相容性是目前急待解決的問(wèn)題。血清蛋白是血漿里最豐富的蛋白質(zhì)。它們能夠攜帶許多其它的不溶于水的分子，如藥物分子，比如布洛芬、吲哚青綠等(Adv.Mater.2016，DOI:10.1002/adma.201600038)。其中牛血清蛋白(BSA)及人血清蛋白(HSA)是目前改善無(wú)機(jī)納米顆粒生物相容性最為有效的手段之一，其無(wú)毒、無(wú)刺激性，且具有良好的水溶性、穩(wěn)定性及生物相容性。更為重要的是BSA或HAS具有許多的活性功能基團(tuán)如羧基、氨基、巰基等，故納米材料經(jīng)BSA或HAS修飾可進(jìn)一步嫁接其他功能分子以推進(jìn)其進(jìn)一步的生物學(xué)應(yīng)用研究(Journal of Controlled Release.2012，157，168–182)。

其中BSA由于其結(jié)構(gòu)性質(zhì)明確(～66KD，17對(duì)二硫鍵)，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，性質(zhì)獨(dú)特，目前已被廣泛用于納米材料的合成修飾研究(Adv.Funct.Mater.2009，19，1451–1458；Chem.Asian J.2011，6，1156–1162)，例如，Prasad.et al.報(bào)道BSA直接合成金，銀，鉑，金-銀，鉑-銀等納米顆粒的方法(J.Mater.Chem.2005，15，5115–5121；Colloids Surf.B 2009，69，239–245)，而Ying et al.在BSA基礎(chǔ)之上更是建立了一種簡(jiǎn)單，綠色的金納米簇成成方法，且獲得金納米簇具有高的熒光產(chǎn)率(J.Am.Chem.Soc.2009，131，888–889)。BSA在其他納米材料如銅，鎘，鈷，鎳等的合成應(yīng)用最近也成為研究的熱點(diǎn)(Adv.Mater.2015，27，3874–3882；Adv.Mater.2016，DOI:10.1002/adma.201506119)。BSA之所以能參與多種金屬納米材料的合成修飾，主要是因?yàn)槠浔旧砼c金屬離子或納米材料之間存在一定的相互作用，雖說(shuō)有最新研究報(bào)道表明鈰納米顆粒與一些多巰基生物分子(如金屬硫蛋白)之間存在氧化還原反應(yīng)作用(Chem.Res.Toxicol.2015，28，2304-2312)，但尚未見(jiàn)用血清蛋白類分子介導(dǎo)合成修飾單獨(dú)鈰納米簇的文獻(xiàn)報(bào)道，更未見(jiàn)基于血清類蛋白介導(dǎo)合成修飾鈰納米顆粒及鈰納米鏈的任何文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)目前鈰納米材料合成修飾中存在的化學(xué)穩(wěn)定性，生物學(xué)活性及生物相容性難以得到有效保證的關(guān)鍵問(wèn)題，建立了一種蛋白介導(dǎo)合成修飾鈰納米材料的方法，通過(guò)一步法實(shí)現(xiàn)了鈰納米簇的合成修飾，同時(shí)通過(guò)簡(jiǎn)易體系調(diào)控，成功實(shí)現(xiàn)了鈰納米顆粒及鈰納米鏈的合成修飾，提供了一種簡(jiǎn)單綠色，多功能的鈰納米材料合成方法，為鈰納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用提供了技術(shù)保障。

該方法首先通過(guò)血清蛋白與鈰鹽簡(jiǎn)單攪拌混合得到鈰納米材料合成前驅(qū)體，進(jìn)一步的在堿性條件下，通過(guò)調(diào)控反應(yīng)的用量，時(shí)間，溫度等條件，成功的合成得到了均一性，穩(wěn)定性及生物相容性好的鈰納米簇、納米顆粒及納米鏈。且鈰納米材料表面的血清蛋白修飾，賦予了其進(jìn)一步功能分子嫁接修飾的可能性。這將對(duì)推進(jìn)鈰納米顆粒的進(jìn)一步生物學(xué)研究，開(kāi)展鈰納米簇及鈰納米鏈新的生物學(xué)應(yīng)用意義重大，作用深遠(yuǎn)。

本發(fā)明的蛋白介導(dǎo)合成修飾鈰納米材料的方法所采用的工藝步驟如下：

(1)將血清蛋白加入到蒸餾水溶液當(dāng)中，取硝酸鈰[Ce(NO₃)₃.6H₂O]加入其中，在600r/min磁力攪拌下，反應(yīng)10～30min后加堿溶液至以上反應(yīng)體系中調(diào)控pH，于室溫反應(yīng)10～30min后停止反應(yīng)，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24～48h，其中每5～8小時(shí)換水一次，換水量在3～5L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽酸、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(4～15mL)套筒離心管中3000～4500r/min多次離心洗滌純化除掉多余未反應(yīng)的蛋白，得到粒徑為1～2nm大小的鈰納米簇(ceria nanoclusters)；

(2)將血清蛋白加入到蒸餾水溶液當(dāng)中，控溫讓血清蛋白維持在較高的溫度水平，待溫度穩(wěn)定后，在800r/min磁力攪拌下，快速將硝酸鈰[Ce(NO₃)₃.6H₂O]加入其中，反應(yīng)10～30min后加堿溶液至以上反應(yīng)體系中調(diào)控pH，并精確控溫反應(yīng)1～4h后停止反應(yīng)，待體系冷卻至室溫后，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24～48h，其中每5～8小時(shí)換水一次，換水量在3～5L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽酸、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(4～15mL)套筒離心管中3000～4500r/min多次離心洗滌純化除掉多余未反應(yīng)的蛋白，得到粒徑為3～4nm大小的鈰納米顆粒(ceria nanoparticles)；

(3)將血清蛋白加入到蒸餾水溶液當(dāng)中，取硝酸鈰[Ce(NO₃)₃.6H₂O]加入其中，在600r/min磁力攪拌下，反應(yīng)10～30min后加堿溶液至以上反應(yīng)體系中調(diào)控pH，于室溫反應(yīng)1～12h后停止反應(yīng)，待冷卻至室溫后，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24～48h，其中每5～8小時(shí)換水一次，換水量在3～5L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽酸、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(4～15mL)套筒離心管中3000～4500r/min多次離心洗滌純化除掉多余未反應(yīng)的蛋白。根據(jù)反應(yīng)時(shí)間的不同可控的得到鏈長(zhǎng)約為20～120nm的鈰納米鏈(ceria nanochains)；

其中，步驟(1)、(2)、(3)中所述中的血清蛋白包括人血清蛋白(HSA)及牛血清蛋白(BSA)，用量為0.25～1.0g；Ce(NO₃)₃.6H₂O用量為100～500uL 0.1mol/L；步驟(1)、(2)、(3)所述堿溶液包括氫氧化鈉(NaOH)及氫氧化鉀(KOH)；用量為200～600uL 1mol/L；反應(yīng)均為10mL體系；步驟(1)、(2)、(3)中所述血清蛋白、鈰鹽、堿溶液的摩爾比為0.5～2：1～5：25～75；

步驟(1)、(2)、(3)中所述ceria nanoclusters、ceria nanoparticles、ceria nanochains中Ce元素濃度均為0.4～1.0mg/mL；步驟(1)、(3)中所述室溫范圍為5～40℃。步驟(2)中所述較高溫度范圍為50～90℃。

與現(xiàn)有鈰納米顆粒合成修飾技術(shù)相比，本發(fā)明有著極大的原創(chuàng)性和顯著的技術(shù)進(jìn)步：

基于蛋白介導(dǎo)合成修飾鈰納米材料的方法，一方面，通過(guò)對(duì)體系的簡(jiǎn)易調(diào)控，成功實(shí)現(xiàn)了鈰納米簇，鈰納米顆粒及鈰納米鏈的合成修飾，且鈰納米材料的均一性，穩(wěn)定性及生物相容性都得到了相應(yīng)的保障；另一方面，相應(yīng)鈰納米材料表面修飾的BSA或HSA具有優(yōu)異的生物學(xué)相容性，且具有大量可供修飾的功能基團(tuán)如羧基、氨基等，可進(jìn)一步嫁接修飾其他功能性分子，為其進(jìn)一步在生物體內(nèi)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。最后，本發(fā)明反應(yīng)綠色經(jīng)濟(jì)，調(diào)控方式靈活易控，重復(fù)性強(qiáng)。

本發(fā)明方法所得到的鈰納米材料在藥物靶向輸送、抗氧化疾病治療及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重大的推動(dòng)作用及應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明提供的蛋白介導(dǎo)合成修飾鈰納米材料的方法示意圖。

圖2是本發(fā)明提供的Ceria nanoclusters的DLS分析圖。

圖3是本發(fā)明提供的Ceria nanoparticles的DLS分析圖。

圖4是本發(fā)明提供的Ceria nanocchains(短鏈)的DLS分析圖。

圖5是本發(fā)明提供的Ceria nanocchains(長(zhǎng)鏈)的DLS分析圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的蛋白介導(dǎo)合成修飾鈰納米材料的方法包括以下步驟：

(1)將血清蛋白加入到蒸餾水溶液當(dāng)中，取硝酸鈰[Ce(NO₃)₃.6H₂O]加入其中，在600r/min磁力攪拌下，反應(yīng)10～30min后加堿溶液至以上反應(yīng)體系中調(diào)控pH，于室溫反應(yīng)10～30min后停止反應(yīng)，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24～48h，其中每5～8小時(shí)換水一次，換水量在3～5L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽酸、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(4～15mL)套筒離心管中3000～4500r/min多次離心洗滌純化除掉多余未反應(yīng)的蛋白，得到粒徑為1～2nm大小的鈰納米簇(ceria nanoclusters)；

(2)將血清蛋白加入到蒸餾水溶液當(dāng)中，控溫讓血清蛋白維持在較高的溫度水平，待溫度穩(wěn)定后，在800r/min磁力攪拌下，快速將硝酸鈰[Ce(NO₃)₃.6H₂O]加入其中，反應(yīng)10～30min后加堿溶液至以上反應(yīng)體系中調(diào)控pH，并精確控溫反應(yīng)1～4h后停止反應(yīng)，待體系冷卻至室溫后，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24～48h，其中每5～8小時(shí)換水一次，換水量在3～5L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽酸、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(4～15mL)套筒離心管中3000～4500r/min多次離心洗滌純化除掉多余未反應(yīng)的蛋白，得到粒徑為3～4nm大小的鈰納米顆粒(ceria nanoparticles)；

(3)將血清蛋白加入到蒸餾水溶液當(dāng)中，取硝酸鈰[Ce(NO₃)₃.6H₂O]加入其中，在600r/min磁力攪拌下，反應(yīng)10～30min后加堿溶液至以上反應(yīng)體系中調(diào)控pH，于室溫反應(yīng)1～12h后停止反應(yīng)，待冷卻至室溫后，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24～48h，其中每5～8小時(shí)換水一次，換水量在3～5L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽酸、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(4～15mL)套筒離心管中3000～4500r/min多次離心洗滌純化除掉多余未反應(yīng)的蛋白。根據(jù)反應(yīng)時(shí)間的不同可控的得到鏈長(zhǎng)約為20～120nm的鈰納米鏈(ceria nanochains)；

其中，步驟(1)、(2)、(3)中所述中的血清蛋白包括人血清蛋白(HSA)及牛血清蛋白(BSA)，用量為0.25～1.0g；Ce(NO₃)₃.6H₂O用量為100～500uL 0.1mol/L；步驟(1)、(2)、(3)所述堿溶液包括氫氧化鈉(NaOH)及氫氧化鉀(KOH)；用量為200～600uL 1mol/L；反應(yīng)均為10mL體系；步驟(1)、(2)、(3)中所述血清蛋白、鈰鹽、堿溶液的摩爾比為0.5～2：1～5：25～75；

步驟(1)、(2)、(3)中所述ceria nanoclusters、ceria nanoparticles、ceria nanochains中Ce元素濃度均為0.4～1.0mg/mL；步驟(1)、(3)中所述室溫范圍為5～40℃。步驟(2)中所述較高溫度范圍為50～90℃。

與現(xiàn)有鈰納米顆粒合成修飾技術(shù)相比，本發(fā)明有著極大的原創(chuàng)性和顯著的技術(shù)進(jìn)步：

基于蛋白介導(dǎo)合成修飾鈰納米材料的方法，一方面，通過(guò)對(duì)體系的簡(jiǎn)易調(diào)控，成功實(shí)現(xiàn)了鈰納米簇，鈰納米顆粒及鈰納米鏈的合成修飾，且鈰納米材料的均一性，穩(wěn)定性及生物相容性都得到了相應(yīng)的保障；另一方面，相應(yīng)鈰納米材料表面修飾的BSA或HSA具有優(yōu)異的生物學(xué)相容性，且具有大量可供修飾的功能基團(tuán)如羧基、氨基等，可進(jìn)一步嫁接修飾其他功能性分子，為其進(jìn)一步在生物體內(nèi)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。最后，本發(fā)明反應(yīng)綠色經(jīng)濟(jì)，調(diào)控方式靈活易控，重復(fù)性強(qiáng)。

本發(fā)明方法所得到的鈰納米材料在藥物靶向輸送、抗氧化疾病治療及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重大的推動(dòng)作用及應(yīng)用前景。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1 鈰納米簇的制備

取0.25g BSA加入到9mL蒸餾水溶液當(dāng)中，取500uL 0.1mol/L Ce(NO₃)₃.6H₂O L加入其中，在600r/min磁力攪拌下，室溫(37℃)反應(yīng)15min后體系少許渾濁，取500uL 1mol/L的KOH加入以上體系中調(diào)控pH～13左右，于室溫(37℃)反應(yīng)15min后停止反應(yīng)，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24h，其中每6小時(shí)換水一次，換水量在3L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(15mL)套筒離心管中4500r/min離心洗滌5次，除掉多余未反應(yīng)的BSA，得到平均水合粒徑為21nm大小的鈰納米簇(ceria nanoclusters，8mL，C_Ce＝0.55mg/mL～I(xiàn)CP-MS，TEM測(cè)定平均大小約為1.2nm)；其水合粒經(jīng)(DLS)分析圖如圖2所示。

實(shí)施例2 鈰納米顆粒的制備

取0.25g BSA加入到9mL蒸餾水溶液當(dāng)中，置于80℃油浴穩(wěn)定10min，在800r/min磁力攪拌下，快速加入500uL 0.1mol/L Ce(NO₃)₃.6H₂O溶液，體系立即渾濁，取500uL1mol/L的KOH一次性加入以上體系中調(diào)控pH～13左右，80℃油浴反應(yīng)5min后體系澄清(淡黃色)，繼續(xù)控溫反應(yīng)2h后停止反應(yīng)，冷至25℃后，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24h，其中每6小時(shí)換水一次，換水量在3L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(15mL)套筒離心管中4500r/min離心洗滌5次，除掉多余未反應(yīng)的BSA，得到平均水合粒徑為25nm大小的鈰納米顆粒(ceria nanoparticles，8mL，C_Ce＝0.72mg/mL～I(xiàn)CP-MS，TEM測(cè)定平均粒徑大小約為3.7nm)；其DLS分析圖如圖3所示。

實(shí)施例3 鈰納米鏈的制備(短鏈～70nm，DLS)

取0.25g BSA加入到9mL蒸餾水溶液當(dāng)中，取500uL 0.1mol/L Ce(NO₃)₃.6H₂O L加入其中，在600r/min磁力攪拌下，室溫(37℃)反應(yīng)15min后體系少許渾濁，取500uL 1mol/L的KOH加入以上體系中調(diào)控pH～13左右，于室溫(37℃)反應(yīng)4h后停止反應(yīng)，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24h，其中每6小時(shí)換水一次，換水量在3L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(15mL)套筒離心管中4500r/min離心洗滌5次，除掉多余未反應(yīng)的BSA，得到平均水合粒徑為65nm大小的鈰納米鏈(ceria nanochains，8mL，C_Ce＝0.65mg/mL～I(xiàn)CP-MS)；其DLS分析圖如圖4所示。

實(shí)施例4 鈰納米鏈的制備(長(zhǎng)鏈～140nm，DLS)

取0.25g BSA加入到9mL蒸餾水溶液當(dāng)中，取500uL 0.1mol/L Ce(NO₃)₃.6H₂O L加入其中，在600r/min磁力攪拌下，室溫(37℃)反應(yīng)15min后體系少許渾濁，取500uL 1mol/L的KOH加入以上體系中調(diào)控pH～13左右，于室溫(37℃)反應(yīng)12h后停止反應(yīng)，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24h，其中每6小時(shí)換水一次，換水量在3L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(15mL)套筒離心管中4500r/min離心洗滌5次，除掉多余未反應(yīng)的BSA，得到平均水合粒徑為145nm大小的鈰納米鏈(ceria nanochains，8mL，C_Ce＝0.78mg/mL～I(xiàn)CP-MS)；其DLS分析圖如圖5所示。

實(shí)施例5 鈰納米鏈的制備(HSA法)

取0.25g HSA加入到9mL蒸餾水溶液當(dāng)中，取500uL 0.1mol/L Ce(NO₃)₃.6H₂O L加入其中，在600r/min磁力攪拌下，室溫(37℃)反應(yīng)15min后體系少許渾濁，取500uL 1mol/L的KOH加入以上體系中調(diào)控pH～13左右，于室溫(37℃)反應(yīng)12h后停止反應(yīng)，將以上反應(yīng)液置于轉(zhuǎn)入截留分子量為10000透析袋中二次蒸餾水透析24h，其中每6小時(shí)換水一次，換水量在3L/次。以除掉未反應(yīng)的鈰鹽、氫氧根(OH^-)及其他無(wú)機(jī)離子。最后置于100kd(15mL)套筒離心管中4500r/min離心洗滌5次，除掉多余未反應(yīng)的HSA，得到平均水合粒徑為150nm大小的鈰納米鏈(ceria nanochains，8mL，C_Ce＝0.62mg/mL～I(xiàn)CP-MS)；

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。